三种结核抗体试剂盒在结核病诊断中的应用评价

2018-01-08刘楠楠梁建琴王金河陈志武丽红刘景阳

中国防痨杂志 2018年1期

关键词：结核结核病例数

刘楠楠梁建琴王金河陈志武丽红刘景阳

·论著·

三种结核抗体试剂盒在结核病诊断中的应用评价

刘楠楠梁建琴王金河陈志武丽红刘景阳

结核；病理学,分子；抗原抗体反应；实验室技术和方法；诊断；评价研究

结核病是全球感染性疾病中发病率和死亡率最高的疾病之一，是威胁全球和我国人群健康的公共卫生问题[1]。结核病疫情严峻，但由于其临床症状和体征不典型，诊断和鉴别诊断较困难，导致漏诊率和误诊率较高，从而延误最佳治疗时机。因此，迫切需要快速、简便、准确的结核病实验室诊断方法，指导临床开展早期有效的诊治工作。

目前，结核病的实验室诊断手段主要包括细菌学、病理学、分子生物学、免疫学等检测方法，其中因血清免疫学检测具有操作简便、快速实用、对活动性结核病具有辅助诊断价值而备受结核病领域学者的广泛关注[2]。为进一步了解目前临床上常用的3种结核抗体试剂盒在诊断结核病中的应用价值，本研究将3种结核抗体(TB-IgG、SD Rapid TB、TB-DOT)试剂盒检测外周血结核抗体的结果与聚合酶链反应反向斑点杂交法(polymerase chain reaction-reverse dot blot，PCR-RDB)行分枝杆菌菌种鉴定(以下简称“分子病理”)的结果进行比较，为临床结核抗体检测效能的评价提供参考。

资料和方法

1.研究对象：收集2015年1—12月解放军第三〇九医院病理科有组织标本分子病理结果的601例患者资料，剔除重复、门诊、院外会诊患者89例，及分子病理为非结核分枝杆菌者7例[戈登分枝杆菌(MGO)6例，龟分枝杆菌(MCH)1例]、病理诊断不明确者149例和未行结核抗体检测者151例，最终纳入205例患者资料。205例患者中男127例、女78例，年龄12～87岁，中位年龄47岁。205例患者的病理标本中，胸腹膜组织88例、骨关节脊柱组织54例、支气管肺组织47例、肾输尿管膀胱组织11例、胸腹壁软组织2例、胃肠组织1例、附睾组织1例、输卵管组织1例。

2.实验试剂：3种结核抗体检测试剂盒分别为TB-IgG[北京中检安泰诊断科技有限公司，胶体金法，相对分子质量38 000(38 kD)+相对分子质量16 000(16 kD)]、SD Rapid TB(韩国SD 标准诊断公司，胶体金法，38 kD+其他混合抗原)、TB-DOT(上海奥普生物医药有限公司，胶体金法，38 kD)；分子病理试剂盒[亚能生物技术(深圳)有限公司，分枝杆菌菌种鉴定]。

3.实验方法：(1)血清结核抗体检测：采集住院患者的晨起静脉血4 ml于带凝胶的红帽血清管中，标本按常规法分离、贮存。实验步骤严格按3种试剂盒说明书的要求进行，每份血清标本均用3种试剂平行测定。(2) 组织分子病理检查：组织标本DNA提取、PCR扩增、杂交、洗膜、显色等严格按照亚能生物技术(深圳)有限公司分枝杆菌菌种鉴定检测试剂盒要求执行[3]。

4.结果判定：(1)分子病理诊断：试验膜条上共有24个探针位点，临床样本与相对应探针杂交位点显色，表明被检样本检测到相对应的分枝杆菌DNA。该研究试验膜条上结核分枝杆菌复合群(MTC)显色为分子病理阳性，不显色为分子病理阴性[3]。(2)血清TB-IgG抗体检测试剂盒结果判定：①阴性即只在质控线C位置出现一条红色条带；②阳性即质控线C和检测线T位置出现2条红色条带；③无效即质控线C位置没有出现红色条带。(3)SD Rapid TB抗体检测试剂盒结果判定：①阴性即显示窗内仅出现一条紫色线；②阳性即显示窗内出现2条彩色线(T线和C线)，或任一条线出现，均说明结果阳性；③无效即显示窗内未出现紫色线。(4)TB-DOT抗体检测试剂盒结果判定：①阴性即质控点显示红色，反应孔中间无红色斑点出现或仅为痕迹；②阳性即质控点显示红色，反应孔中间有红色斑点出现。上述结果中阳性提示感染结核分枝杆菌，阴性表示未感染结核分枝杆菌。

5.统计学分析：应用SPSS 20.0统计学软件，采用McNemar检验对3种结核抗体试剂盒检测结果与分子病理诊断结果进行比较，有小于5的理论数，采用McNemar检验的Continuity Correction(连续矫正)检验，均以P<0.05认为差异有统计学意义。采用Kappa检验检测结果的一致性，将Kappa系数的大小划分了6个区段，分别代表一致性的强弱程度：(1)Kappa值<0.00则为一致性强度极差；(2)Kappa值0.00～0.20则为一致性微弱；(3)Kappa值0.21～0.40则为一致性弱；(4)Kappa值0.41～0.60则为中度一致性；(5)Kappa值0.61～0.80则为高度一致性；(6)Kappa值0.81～1.00则为极强一致性。

结果

1.分子病理检测情况：205例患者中，传统病理诊断为结核病(结核病组)且分子病理检测阳性者128例，均为结核分枝杆菌复合群，分别为脊柱骨关节结核37例，腹盆腔结核(结核性腹膜炎、肠结核、输卵管结核)35例，结核性胸膜炎31例，支气管结核肺结核19例，肾结核4例，胸腹壁结核1例，附睾结核1例；传统病理诊断明确为非结核病(非结核病组，不包括7例非结核分枝杆菌感染患者)且分子病理检出阴性者77例，分别为胸腹膜间皮瘤15例，肺癌12例，肺炎9例，肺良性肿瘤7例，骨关节感染11例，脊柱布氏杆菌病6例，胃肠道肿瘤8例，泌尿系肿瘤7例，肝肿瘤1例，乳腺脂肪瘤1例。

2.结核抗体试剂盒的检测效能：以分子病理检查结果为标准， TB-IgG、SD Rapid TB、TB-DOT等3种试剂盒的敏感度分别为26.6%(34/128)、20.3%(26/128)、97.7%(125/128)；特异度分别为90.9%(70/77)、98.7%(76/77)、3.9%(3/77)；阳性预测值分别为82.9%(34/41)、96.3%(26/27)、62.8%(125/199)；阴性预测值分别为42.7%(70/164)、42.7%(76/178)、50.0%(3/6)；正确指数分别为0.18、0.19、0.02，见表1。

3.试剂盒检测结果的差异性和一致性比较：从表1看，TB-IgG和SD Rapid TB试剂盒的检测结果与分子病理结果比较，诊断差异均有统计学意义(P值均<0.05)；Kappa值均在0.00～0.20范围内，表明与分子病理结果均存在微弱的一致性。而TB-DOT试剂盒检测结果与分子病理结果比较，诊断差异无统计学意义(P>0.05)；Kappa值=0.02，不能肯定与分子病理结果存在一致性。

讨论

我国现行的结核病诊断标准仍是依据临床表现、影像学表现、细菌病原学和免疫学等检查结果。但WHO在2010年12月正式推荐使用Gene Xpert MTB/RIF检测技术作为一种全新的结核病分子生物学快速检测方法，用于结核病及利福平耐药的诊断。由于肺外结核的病原不易获得，大多依靠影像学和治疗效果进行诊断，所以对MTB-DNA检测(分子病理)在诊断肺外结核中的应用越来越得到临床医生的认可，对疑似结核病和肺外结核的诊断具有辅助作用。结核抗体检测对活动性结核病的诊断具有重要意义，尤其对涂阴、培阴、无痰、少痰及肺外结核是首选的检测手段[4-5]。外周血结核抗体检测具有快速、简便、敏感等优势[6]，其阳性检出率(80.0%)明显高于痰涂片法(28.1%)[7]和培养法(48.7%)[8]，较痰涂片、培养法(周期2～8周)更具应用价值，尤其在感染早期MTB菌量少或化疗后细菌变异、死亡而难以培养时，其检测优势更明显[9]。

结核抗体是机体受到结核分枝杆菌刺激后产生的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE等，其中IgG、IgM和IgA常用于临床辅助诊断。在结核病发病过程中，最初是IgM升高，随后IgG持续升高，并贯穿结核病始末，与高荷菌量相关联[10]。乔帅[11]的研究表明，非活动性肺结核的结核抗体检测阳性率为53.85%，而活动性肺结核的阳性率则高达94.59%。38 kD、30 kD、27 kD、16 kD是从结核分枝杆菌中提取的蛋白，能与血清IgG、IgA、IgM特异性结合。研究发现，单个抗原的检测敏感度为57%～67%，当与38 kD联合应用时，在结核分枝杆菌阳性者中其敏感度提高至91%，在结核分枝杆菌阴性者中提高至78%、特异度提高至97%[12]；Wu等[13]也有类似的报道。由此可见，结核病的快速、准确诊断有赖于多种抗原联合检测来提高敏感度和特异度，而38 kD在提高检测敏感度和特异度方面效果显著。

表1 3种结核抗体试剂盒的检测效能比较

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%[a/(a+c)×100%]；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%[d/(b+d)×100%];阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%[a/(a+b)×100%];阴性预测值=真阴性例数/(假阴性例数+真阴性例数)×100%[d/(c+d)×100%];正确指数(约登指数)=(敏感度+特异度)-1；e：3种结核抗体试剂盒的检测结果与分子病理检测结果的统计学检验结果；f:Kappa值的检验值，因理论频数小于5，为用McNemar检验连续矫正(continuity correction)的检验值

本研究中3种试剂盒均含有38 kD，其中，TB-DOT 试剂盒仅有38 kD单抗原，检测敏感度高达97.7%，但特异度较低(3.9%)，阳性预测值为62.8%，阴性预测值为50.0%，与以往报道(敏感度为50%～75%，特异度为91.64%)不一致[6,14]。另外，该试剂盒与分子病理比较，正确指数仅为0.02，Kappa值为0.02，P>0.05，不能肯定两种方法存在一致性。由此可见，TB-DOT试剂盒虽检测敏感度高，降低了漏诊率，但特异度低导致误诊率大大增加，不能满足临床需求。故本研究结果提示，不推荐其作为临床治疗有效的检测手段。原因一方面由于用于血清学检测的抗原较多，不同的抗原自身特性不同，加之患者的不同病程阶段对每种抗原的反应也存在差异，必将影响相应抗体检测的敏感度和特异度。所以，试剂盒仅含有38 kD抗原，只检测38 kD抗原无法检测出患者血清中的其他抗结核抗体。另一方面可能与试剂盒的批次、质量、结核分枝杆菌变异、质量控制等有密切关系，影响了其在临床上的应用。TB-IgG和SD Rapid TB试剂盒为38 kD与其他抗原的混合；与TB-DOT相比，在特异度方面明显提升(90.9%，98.7%)，但敏感度(26.6%、20.3%)均较低。但多数研究结果提示，TB-IgG的敏感度(78.08%)高于本研究结果(26.6%)[2]，可能由于试剂盒的质量、批次、保存条件、操作员判读、患者低免疫球蛋白水平和自身抗体等原因，出现一些假阴性。但本研究TB-IgG特异度为90.9%，更有助于结核病的确诊。SD Rapid TB检测的敏感度、特异度分别为20.3%、98.7%，这与相关文献的报道结果(24.1%～39.2%)基本一致[15-16]。本研究中，TB-IgG试剂盒检测结果与分子病理诊断结果比较，正确指数为0.18，Kappa值为0.14；而SD Rapid TB试剂盒的正确指数为0.19，Kappa值为0.15。由此可知，TB-IgG和SD Rapid TB试剂盒检测结果均与分子病理诊断结果存在微弱的一致性，但SD Rapid TB的Kappa值和正确指数稍高，在3种检测方法中相对较好。

本研究将3种结核抗体试剂盒检测结果与分子病理结果进行比较，在国内外尚未见报道。本研究传统病理诊断明确的205例行分子病理检测的组织标本中仅有47例来自于支气管肺组织，其余158例均为肺外组织标本，推测TB-IgG和SD Rapid TB 2个试剂盒检测的敏感度较低，可能与分子病理检测的是MTB DNA而不是活菌有关，也就是说我院的手术标本中有部分可能是陈旧性或稳定性的肺外结核。下一步笔者将追踪患者的其他指标，如现病史、既往史、血红细胞沉降率、病理抗酸染色和培养、治疗效果和不同治疗阶段抗体水平等，综合客观地判断结核抗体对肺结核、肺外结核的临床辅助诊断价值。

[1] World Health Orgnization.Global tuberculosis report 2016.Geneva: World Health Orgnization，2016.

[2] 蔡新霞,王容侠,宋晓佳.血清结核分枝杆菌IgG抗体检测对结核病的诊断价值.中国热带医学,2015,15(2):236-237.

[3] 穆晶,赵丹,刘子臣,等.荧光定量PCR技术在骨关节结核石蜡包埋标本检测中的应用价值.结核病与胸部肿瘤，2016,5(3):199-203.

[4] Ben-Selma W,Harizi H,Boukadida J.Immunochromatographic IgG/IgM test for rapid diagnosis of active tuberculosis.Clin Vaccine Immunol,2011,18(12):2090-2094.

[5] Welch RJ,Lawless KM,Litwin CM.Antituberculosis IgG antibodies as a marker of activeMycobacteriumtuberculosisdisease.Clin Vaccine Immunol,2012,19(4):522-526.

[6] 夏强,傅潺潺,竺祖军,等.结核抗体IgG/IgM检测在肺结核和肺外结核中的诊断价值.中国人兽共患病学报，2014,30(10)：1052-1056.

[7] 赵楠.肺结核患者结核抗体与痰涂片检验效果比较.当代医学,2017,23(1):77-78.

[8] 李娜，邱珊.458份痰抗酸染色涂片和结核杆菌快速培养的结果比较.甘肃医药，2013，32(10)：732-734.

[9] 杨一典.检测结核抗体在结核病诊断中的临床应用价值.吉林医学,2014,35(2):304-305.

[10] Grange JM,Gibson J,Nassau E,et al.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): a study of antibodies toMycobacteriumtuberculosisin the IgG,IgA and IgM classes in tuberculosis,sarcoidosis and Crohn’s disease.Tubercle,1980,61(3):145-152.

[11] 乔帅.酶联免疫吸附试验诊断结核病的临床检测意义.世界最新医学信息(电子版),2016,16(13):132.

[12] Raja A,Ranganathan UD,Bethunaickan R.Improved diagnosis of pulmonary tuberculosis by detection of antibodies against multipleMycobacteriumtuberculosisantigens.Diagn Microbiol Infect Dis,2008,60(4):361-368.

[13] Wu X,Yang Y,Zhang J,et al.Humoral immune responses against theMycobacteriumtuberculosis38-kilodalton,MTB48,and CFP-10/ESAT-6 antigens in tuberculosis.Clin Vaccine Immunol,2010,17(3):372-375.

[14] 颜京瑞.检测结核抗体对结核病的临床诊断价值.检验医学与临床，2010,7(2):113,115.

[15] Ekundayo EO，Abbey SD，Okorie O.Comparison of sputum smear microscopy and rapid tuberculosis antibody detection test kits for diagnosis of pulmonary tuberculosis in Abia State,Nigeria.Journal of Health Science,2014,2(5):207-212.

[16] 冯金栋，阳幼荣，吴雪琼，等.结核分枝杆菌Rv2041c重组蛋白在结核病诊断中的应用价值.实用医学杂志,2012,28(22):3732-3735.

Evaluationofthreetuberculosisantibodykitsintuberculosisdiagnosis

LIUNan-nan,LIANGJian-qin,WANGJin-he,CHENZhi,WULi-hong,LIUJing-yang.

DepartmentofTuberculosis,theTuberculosisReserchInsititute,the309thHospitalofChinesePLA,Beijing100091,China

LIANGJian-qin,Email:ljqbj309@163.com