烟叶生物碱组成差异对白肋烟高温贮藏前后TSNAs形成的影响

王俊，史宏志，靳彤，张梦玥，周骏，杨惠娟，白若石

1 河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室/烟草农业减害研究中心，河南 郑州450002；2 上海烟草集团北京卷烟厂，北京100024

烟草特有亚硝胺（Tobacco Specific N-nitrosamines,TSNAs）是由烟草生物碱与含氮氧化物发生亚硝化反应生成的主要存在于烟叶和烟气中的有害成分，主要有N-亚硝基降烟碱（NNN）、4-(N-甲基-亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK）、N-亚硝基新烟草碱（NAT）和N-亚硝基假木贼碱（NAB）4种[1-3]。一般来说鲜烟叶中不含TSNAs或含量极低，TSNAs的形成和积累主要在调制和贮藏过程中[4]。NNN、NAT和NAB分别由降烟碱、新烟草碱和假木贼碱发生亚硝化反应生成，而NNK则是烟碱的氧化产物假氧环烟碱（PON）进一步发生亚硝化反应的产物[5]。调制过程中，烟叶的硝酸盐被微生物还原为亚硝酸盐进而与生物碱作用形成TSNAs[6]。调制后烟叶生物碱含量及组成与贮藏过程中TSNAs的形成和积累密切相关[7-9]，烟草类型[10-11]、品种[4,8]、调制方式[12-13]和晾制的温、湿度条件[14]对烟叶生物碱含量有重要影响。Lewis等[15]报道白肋烟TSNAs含量高于烤烟，是由于其两个隐性基因位点（Yb1和Yb2）导致生物碱水平提高，氮利用效率降低，叶片硝态氮含量增加。烟草栽培品种的烟碱转化程度和降烟碱含量与NNN和TSNAs总量呈极显著正相关关系[16-17]。Cai等[18]研究表明调制过程中，受烟碱脱甲基酶基因CYP82E4的影响，晾晒烟中NNN的形成与降烟碱密切相关，而NNK、NAT和NAB几乎不受相应的前体物影响。

白肋烟的贮藏阶段是TSNAs形成的又一个重要时期，烟叶贮藏过程TSNAs含量可提高50%至数倍，尤其在高温季节TSNAs的积累更为迅速[19]。De Roton等[20]报道贮藏在环境温度下的白肋烟粉碎样品，6个月后TSNAs含量由1.3～1.4 μg/g增加到8.1～9.5 μg/g。白肋烟TSNAs含量随着贮藏时间的延长大幅增加[19]；贮藏后TSNAs增加量与温度和硝态氮含量有密切关系[21]，高温下硝态氮产生氮氧化物可能是造成TSNAs积累的主要原因。而关于TSNAs另一前体物生物碱对贮藏过程中TSNAs形成和积累的影响尚不清楚。本研究通过TN86不同烟碱转化株系在相同的种植、田间管理以及晾制方式下，选择总生物碱含量相近，而生物碱组成差异明显的烟叶样品进行高温贮藏处理，探究烟叶生物碱含量对贮藏过程中TSNAs形成的影响，为进一步揭示烟叶贮藏过程中TSNAs的形成机理和制定抑制烟叶贮藏过程中TSNAs形成的有效技术提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和地点

本实验于2014年在云南省大理州进行，以经鉴别具有不同烟碱转化率PNC（Percentage nicotine conversion）的TN86株系为试验材料，包括改良种1（PNC＜5）、低转化株系（5＜PNC＜20）、高转化株系1（PNC＞20）、高转化株系2（PNC＞50）[22]。

1.2 试验方法

田间种植4个TN86的改良种和转化株系各 100株。供试土壤为壤土，中等肥力。试验田面积约400 m2，密度16500株/ hm2，氮用量225 kg/hm2，N∶P2O5∶K2O比例为l∶l∶3。按常规方法育苗，5月8日移栽，移栽后30 d在每类改良种和转化株系中随机选取20～25株挂牌编号，共90株。烟叶成熟后，整株砍收，在标准晾房内晾制后，每株均单独取样，选取中部叶，切丝测定其生物碱含量，计算烟碱转化率。

根据烟碱转化率（[降烟碱含量/（烟碱含量+降烟碱含量）]×100），将烟株分为非转化株（烟碱转化率低于5%）、低转化株（烟碱转化率5%到20%）、中转化株（烟碱转化率20% ～ 50%）和高转化株（烟碱转化率大于50%）[14]。取样的90个烟株中烟碱转化程度差异较大，非转化株占17.8%，低转化株占31.3%，中转化株占27.8%，高转化株为23.3%。选取生物碱总量在4% ～ 6%之间的样品，根据烟碱、降烟碱及烟碱转化率的不同分为6组，每组样品包括4% ～ 6%个转化株，分别将各组烟丝样品混合均匀，测定生物碱、NO3-N、NO2-N和TSNAs的含量。

分别称取混合后的6组烟丝样品各20 g，装入蓝盖玻璃瓶中，放置到45℃、60%RH恒温恒湿箱内贮藏12 d后取出，每个处理设3次重复。45℃处理前后烟叶的平均含水率分别为12%和11.6%。

1.3 化学成分的测定

烟叶贮藏12 d后进行冷冻干燥，磨碎后过250µm筛。

1.3.1 TSNAs含量测定

样品送至上海烟草集团北京卷烟厂进行TSNAs测定。测定方法为在线SPE-液相色谱质谱联用（SPE-LC-MS/MS）法 （SPE-LC：Spark Holland,Symbiosis (Pico)；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500）。称1.0 g烟样，放入50 mL锥形瓶中，加40µL 4种氘代TSNAs（内标）溶液（5000 ng/mL）和30 mL 100 mmol/L乙酸铵水溶液，室温下振荡（200 r/min）萃取60 min，萃取液过0.45 µm水相滤膜，LC-MS/MS检测TSNAs[23]。总TSNAs是NNN、NNK、NAT和NAB的含量之和。

1.3.2 NO3-N和NO2-N的测定

NO3-N和NO2-N的测定采用比色法，参照Crutchfield 和Grove[24]的方法。

1.3.3 生物碱的测定

在碱性条件下，用甲基叔丁基醚（MTBE）提取200 mg样品的生物碱，以正十六烷为内标，参照Jack 和Bush的方法[25]，气相色谱-氢火焰离子化检测器（GC-FID）(Agilent 7890A，Agilent Technologies，USA) 定量检测4种生物碱的含量。

1.4 数据分析

采用Excel和Origin 8.5进行数据处理和绘图。运用SPSS 20.0软件进行相关分析、偏相关分析和逐步回归分析。设P＜0.05，P＜0.01 。

2 结果与分析

2.1 白肋烟TN86不同转化株的烟叶TSNAs前体物含量

由表1和图1可知，TN86不同转化株在相同的栽培方式、施肥量以及取样和晾制方法的条件下，烟叶的4种生物碱及烟碱转化率株间差异明显。假木贼碱和新烟草碱的含量较低，样品间变异性较小。烟叶中烟碱和降烟碱含量稍高，烟株间的差异明显，其中以降烟碱的变异性最大，最大值为6.21%，最小值仅为0.03%。烟碱含量的变化为0.25%～7.69%，差异较大，这与烟株间烟碱转化率变异程度较高有密切的关系。取样的90株样品中，生物碱总量最高的达到9.22%，最低的仅为0.76%，其中42%的烟株生物碱总量在4% ～ 6%。

表1 TN86群体生物碱含量及烟碱转化率Tab.1 Alkaloid content and nicotine conversion rate in cured leaves of TN86

图1 TN86不同烟株调制后的烟碱转化率Fig.1 Distribution of nicotine conversion rate in individual plants of TN86

为了研究4种生物碱组成的差异对高温贮藏过程中TSNAs形成的影响，进一步筛选了生物碱含量在4%～6%左右，烟碱和降烟碱含量差异较大，烟碱转化率呈梯度差异的烟叶样品，分为6组，将组内样品混合均匀后，测定其生物碱和NO3-N、NO2-N含量。从表2可以看出，随着烟碱转化率的提高，烟碱含量明显减少，降烟碱含量逐渐增多，假木贼碱含量较低，且组间无明显差异。与烟碱和降烟碱的组间差异相比较，6组样品的总生物碱、NO3-N和NO2-N含量的差异较小。

表2 TN86不同烟碱转化率的分组情况Tab.2 Groups of different nicotine conversion rate in TN86

2.2 生物碱组成差异对高温贮藏前后烟叶TSNAs含量的影响

将烟碱和降烟碱含量有较大差异的6组样品（表2）在45℃高温贮藏12 d，贮藏前后TSNAs的含量如图2和图3所示。贮藏前后，随着降烟碱和烟碱转化率的提高，烟叶NNN和总TSNAs含量的增长幅度逐渐加大。当烟碱转化率为76.7%，TSNAs总量最高，是烟碱转化率为2.8%的2.7倍；45℃贮藏后总TSNAs的增加值最多，高出2.8%处理时增加值411 ng/g。烟叶NNK的含量随着前体物烟碱的降低而逐渐减少，贮藏后的增加值也明显降低。

图2 不同烟碱转化率的白肋烟45℃贮藏12 d后TSNAs含量Fig.2 Four individual TSNAs contents in burley tobacco with different nicotine conversion rate after 45°C storage for 12d

2.3 生物碱含量与高温贮藏前后TSNAs含量关系

2.3.1 与贮藏前TSNAs含量的关系

表3为贮藏前TSNAs含量与生物碱及硝态氮等相关分析的结果，烟叶NNN含量和TSNAs总量与降烟碱含量及烟碱转化率呈极显著的正相关关系（P＜0.01）。在本实验条件下，NNK含量与其前体物烟碱呈显著的正相关关系，与降烟碱和烟碱转化率表现出负相关。贮藏前，烟叶TSNAs的形成受NO3-N和NO2-N的影响不显著。

表3 烟叶TSNAs含量与生物碱、NO3-N和NO2-N含量的相关系数Tab.3 Correlation coefficients of tobacco TSNAs content and alkaloid, NO3-N, NO2-N content

2.3.2 与贮藏过程中TSNAs增加量的关系

为了明确贮藏后烟叶TSNAs的增加值与生物碱含量的关系，探究高温贮藏过程中TSNAs积累的来源，采用简单相关、偏相关和逐步回归分析对TSNAs增加值与生物碱和硝态氮含量进行分析，结果见表4。对NNN，NNK和TSNAs的增加值与前体物进行简单相关和偏相关分析，结果基本一致，由相关系数可知，NNN和TSNA总量的增加值与降烟碱和烟碱转化率呈极显著正相关，说明降烟碱对TSNAs积累的直接作用较大。NNK的增加值与烟碱成显著正相关，也受到降烟碱的影响，这与实验设置中烟碱和降烟碱的含量有关。在本实验的条件下，NAT和NAB的增加值与它们的前体物新烟草碱、假木贼碱表现出负相关，可能是由降烟碱亚硝化的竞争导致的。

进一步以高温贮藏后4种TSNAs及TSNAs总量的增加值为因变量，NNN增加值（Y1）、NAT增加值（Y2）、NAB增加值（Y3）、NNK增加值（Y4）和TSNAs增加值（Y5），以NO3-N（X1）、NO2-N（X2）、烟碱（X3）、降烟碱（X4）、假木贼碱（X5）、新烟草碱（X6）、总生物碱（X7）和烟碱转化率（X8）为自变量，进行逐步回归分析，建立回归方程如下：

Y1=432.2-287.3X4（R2=0.97），说明NNN的增加量与前体物降烟碱（偏相关系数0.98，P＜0.01）有密切关系。

Y2=318.3-95.8X4（R2=0.82），说明NAT的增加量受降烟碱（偏相关系数-0.90，P＜0.05）的影响。

Y3=73.7 -4.5X2＋1.5X3（R2=0.94），NAB的增加值与NO2-N（偏相关系数-0.68，P＜0.05）和烟碱（偏相关系数0.42，P＜0.05）的关系更为密切。

Y4=157.4-36.5X4（R2=0.89），NNK的增加量与降烟碱（偏相关系数-0.94，P＜0.05）有密切关系。

Y5=1687.4-338.9X4（R2=0.94），TSNAs的增加量与降烟碱（偏相关系数0.97，P＜0.01）有密切关系。

由上述结果可知，在总生物碱、NO3-N和NO2-N含量相近的条件下，4种生物碱中，降烟碱与NNN增加量密切相关，是影响高温贮藏后TSNAs积累程度的主要因素。

表4 45℃贮藏后TSNAs增加值与生物碱、NO3-N和NO2-N含量的相关系数Tab.4 Correlation coefficients of the TSNAs increment in tobacco after 45°C storage with alkaloid, NO3-N, NO2-N contents

3 讨论

普通烟草（N.tabacum）的生物碱以烟碱为主，占总生物碱含量的93%以上，降烟碱占2.5%～5%，个别烟株因不稳定转化基因位点被激活而具备了烟碱去甲基的能力，导致烟碱转化成降烟碱，白肋烟群体中烟碱转化的问题较突出[5,7,9]。TSNAs是烟草生物碱发生亚硝化反应的产物，关于TSNAs与前体物的关系有一些矛盾的报道，这无疑与试验所用材料的生物碱和亚硝酸盐含量[8]、调制环境和方法[12-13]以及烟碱脱甲基酶的功能等有关[18,26]。本实验采用同样的栽培条件和调制方式，使白肋烟烟叶的硝态氮含量相近，贮藏12d后NNN和TSNAs总量与降烟碱及烟碱转化率呈极显著的正相关（P＜0.01），这与前人的研究结果一致[5,17,27]。可能是由于仲胺类的降烟碱比叔胺类的烟碱更容易发生亚硝化反应生成TSNAs，烟碱大量向降烟碱转化直接促进了NNN的积累。

生物碱、硝酸盐和亚硝酸盐都是TSNAs形成的前体物，课题组前期的研究通过控制白肋烟氮肥用量、氮素形态和向烟叶中添加外源硝态氮等措施得到硝态氮含量差异较大的样品，进行高温贮藏后，发现烟叶硝态氮含量与贮藏后TSNAs的增加量显著正相关[19,21]。本研究对 总生物碱和硝态氮含量较一致，而烟碱和降烟碱有较大差异的样品进行45℃高温贮藏后，发现4种TSNAs和TSNAs总量虽然均远高于贮藏前，但TSNAs在贮藏过程中的增加量受生物碱含量，特别是烟碱和降烟碱含量的强烈影响，一方面由于它们本身含量较高，也与实验设置有关。烟碱转化导致烟碱含量降低和降烟碱含量增高，在高温贮藏过程中NNK和NNN增加量也呈相反变化，尤其是随着降烟碱和烟碱转化率的增加，NNN的含量明显升高，且增长幅度逐渐加大。烟碱转化率为2.8%时，NNN的增加值占TSNAs总增加值的44%；当转化率为76.7%时，NNN的增加值所占比例增长到94%。这可能是因为降烟碱为仲胺类生物碱，比叔胺类的烟碱更不稳定，更容易发生亚硝化反应而生成NNN，这也是造成在总生物碱含量相近的条件下，随着降烟碱含量比例增加，高温贮藏后总TSNAs含量显著增加的主要原因。在本实验条件下，相关和逐步回归分析显示贮藏后烟叶TSNAs、NNN的增加值均与降烟碱呈直接正相关，NNK的增加值随着烟碱含量的降低而逐渐减少，也受到降烟碱的竞争性抑制。NAT和NAB的增加值与它们前体物新烟草碱、假木贼碱无显著的相关关系，回归分析显示它们受到烟叶烟碱和降烟碱含量的一定影响，这可能是因为在TSNAs形成过程中前体物之间的竞争性抑制造成的，与CYP82E4等基因的调控有关[18,26]。此外，烟叶中的TSNAs属于纳克级成分，种植条件、烟草品种和检测精度均会影响TSNAs及其前体物的含量，由于方法的局限本文检测的是自由态的TNSAs，忽略了结合态的TSNAs[28]，因此，有关生物碱之间亚硝化反应的竞争及其对TSNAs的影响有待于进一步的研究。

综合本研究结果和前期的研究结果，我们认为在高温贮藏过程中，TSNAs形成与前体物硝态氮和生物碱含量具有密切相关，在生物碱含量相近的条件下，硝酸盐和亚硝酸含量的高低成为TSNAs增加量的主导因素；而在硝酸盐、亚硝酸含量相近的条件下，生物碱的差异，尤其是容易发生亚硝化反应的仲胺类生物碱对TSNAs的形成和积累起重要作用。

4 结论

在生物碱总量、NO3-N和NO2-N含量相近条件下，烟叶中降烟碱含量和烟碱转化率与TSNAs形成和积累关系密切；高温贮藏后，4种TSNAs和TSNAs总量均远高于贮藏前，NNN的增加量与降烟碱呈极显著正相关。烟碱转化导致降烟碱比例增加是造成白肋烟贮藏过程中TSNAs大量形成和积累的主要原因。

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