新鉴定高抗TMV普通烟草枯斑资源的N导入片段长度多样性

刘勇，李梅云，于海芹，黄昌军，李永平

云南省烟草农业科学研究院/烟草行业烟草生物技术育种重点实验室/国家烟草基因工程研究中心 昆明，650021

烟草花叶病毒病（TMV）是我国烟草的重要病害，每年造成的损失位列十大烟草侵染性病害名单前列[1-2]。种植抗病品种是防控TMV最根本和最经济有效的手段，我国已经选育10多个高抗TMV的常规品种[3-4]和杂种1代品种[5-9]，但这些高抗TMV品种的推广面积不大。优良抗源是选育高抗且丰产优质品种的关键之一。烤烟品种TMV抗性主要来源于烟草野生种心叶烟（Nicotiana glutiosa），其抗性由一个显性单基因（N）控制[10]。通过一系列的常规杂交和回交转育，N基因抗性从心叶烟转育至香料烟中，然后转育至白肋烟和烤烟品种中[11-14]。常规杂交和回交转育的是携带N基因的心叶烟染色体片段，简称N导入片段。N导入片段上与N基因紧密连锁的心叶烟基因在烤烟品种中导致连锁累赘，表现为产量较低、初烤烟叶外观质量稍差[15-17]。N导入片段较短的资源，推测其连锁累赘可能较小，育种利用潜力较大。

目前我国用于选育抗TMV烤烟品种的抗病亲本数量少，主要有9501、8022、Coker176、Ky56、Coker86、CV58、CV87、KX13等[6-8,18]。我国收集保存了4000多份烟草种质资源，据不完全统计，至2016年对约2000份种质资源（包含重复鉴定资源）开展过TMV抗性鉴定[19-28]，2016年云南省烟草农业科学研究院采用人工接种鉴定出94份国外新引的高抗TMV的种质资源，其中大部分属于接种TMV表现枯斑的普通烟草（简称普通烟草枯斑资源）[28]。普通烟草资源包括烤烟、白肋烟、香料烟、晒烟、雪茄烟，不包括黄花烟、野生烟和种间杂交种。这些新鉴定高抗TMV抗源的育种利用，需要明确是否携带N基因以及N导入片段长度。刘勇等基于番茄的基因组物理图谱开发了定位N导入片段的分子标记[29]。本文利用分子标记对63份普通烟草枯斑资源的N导入片段长度进行了鉴定，可为抗TMV种质资源的育种利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

普通烟草枯斑资源63份（表1），来源于云南省烟草农业科学研究院2016年新鉴定出高抗TMV的烟草资源[27-28]。每份资源挑选3株采集幼叶，-80℃保存，分别用于提取DNA。以N基因阴性的K326为N导入片段阴性对照。

1.2 DNA提取

采用QIAGEN DNeasy Plant Mini试剂盒提取烟草总基因组DNA。采用紫外分光光度法（Nanodrop）和琼脂糖凝胶电泳法初步检测DNA质量。质量合格的DNA样品，用0.5×TE溶液稀释至30～50 ng/μL，保存备用。

1.3 分子标记检测与N导入片段大小估算

分子标记检测：PCR 反应体系总体积均为20 μL，其中30～50 ng/μL DNA 样品2.5 μL、10×PCR buffer 2.0 μL，dNTPs 1.2 μL，分子标记引物各1.5 μL，rTaq 酶0.3 μL，ddH2O 11.0 μL。所用试剂购自宝生物公司。PCR反应在Eppendorf梯度扩增仪上（Master Cycler）上进行。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存；采用2%的琼脂糖凝胶进行检测。

首先采用N基因的特异分子标记N1N2鉴定出携带N基因的普通烟草资源[30]。然后采用N导入片段的分子标记（GL3.50，GL4.06，N1N2，TN5.226，TN5.51）检测N导入片段的长度[29]。N1N2标记对应于番茄11号染色体4.39Mb处的N基因同源体，在估算N导入片段长度时，本文以TN4.39表示。根据N导入片段特异分子标记检测结果（阴性或阳性），判断N导入片段缺失或者携带该标记对应的DNA片段。利用N导入片段的左右末端邻近的两个标记扩增结果估算导入片段长度。若距离N基因近的一侧标记为阳性，距离N基因远的一侧标记检测为阴性，表明该资源的N导入片段末端位于这两个标记之间。由于N导入片段的基因组尚未组装为可计算物理距离的染色体，烟草N导入片段的长度用其左右末端阳性标记对应番茄11号染色体的物理距离表示。

2 结果与分析

2.1 普通烟草中N导入片段长度的类型

对文献报道的普通烟草枯斑资源，首先采用N基因特异分子标记筛选出携带N基因的资源，然后检测N导入片段的长度。根据N基因和N导入片段的分子标记的检测结果，供试的63份普通烟草枯斑资源可划分为3大类型，以最常见的代表种质命名为：Coker176类型：GL3.50和GL4.06检测阴性、TN4.39、TN5.226、TN5.51检测阳性；Samsun NN类型：GL3.50、 GL4.06、TN4.39、TN5.226检测阳性，TN5.51检测阴性；Xanthi nc 类型：GL3.50、GL4.06、TN4.39、TN5.226、TN5.51检测阳性，其中TN5.77为普通烟草的标记，TN5.77检测阳性表明N导入片段对应的标记为阴性（图1，图2）。

图1 3种类型资源的N导入片段分子标记检测Fig.1 Three types of germplasms tested by molecular marker of N introgression segment

图2 3种N导入片段长度类型示意图Fig.2 Diagram of three length types of N introgression segment

2.2 普通烟草枯斑资源的N导入片段长度多样性

N导入片段的长度用其左右末端阳性标记的基因组物理距离表示。63份普通烟草枯斑资源采用N基因分子标记N1N2检测都为阳性， 5个N导入片段特异的分子标记检测结果表明（表1）：402等51份资源的N导入片段长度属于Coker176类型，为GL4.06阴性、TN4.39、TN5.51和TN5.77阳性。GL4.06标记和TN4.39标记在番茄11号染色体上为位置分别为4.06 Mb和4.39 Mb，TN5.51标记和TN5.77标记在番茄11号染色体上为位置分别为5.51 Mb和5.77 Mb。TN4.39与TN5.51标记对应于番茄染色体的物理距离为1.12 Mb， GL4.06和TN5.77对应于番茄染色体的物理距离为1.71 Mb。因此，Coker176的N导入片段的相对长度范围为1.12 Mb～1.71 Mb（参比番茄11号染色体，图2）。

Ky160等2份资源的N导入片段长度属于Samsun NN类型，GL3.50标记和TN5.226标记检测为阳性，TN5.51标记为阴性。GL3.50标记和TN5.226标记在番茄11号染色体上为位置分别为3.50 Mb和5.226 Mb，二者的物理距离为1.726 Mb，因此Samsun NN的N导入片段相对长度为大于1.726 Mb小于2.01 Mb（参比番茄11号染色体，图2）。

Ky52等10份资源的N导入片段长度属于Xanthi nc类型。Xanthi nc和Xanthi-parental的N导入片段较长，GL3.50标记和TN5.51标记检测Xanthi nc为阳性，GL3.50标记和TN5.51标记在番茄11号染色体上为位置分别为3.50 Mb和5.51 Mb，二者的物理距离为2.01 Mb，因此Xanthi nc的N导入片段相对长度为大于2.01 Mb（参比番茄11号染色体，图2）。

表1 部分枯斑资源的N导入片段长度多样性Tab.1 N introgression segment length polymorphism of local germplasms

3 讨论与结论

本文将30℃条件下接种TMV表现为枯斑的普通烟草资源简称为“普通烟草枯斑资源”。我国利用人工接种鉴定出的高抗TMV种质资源分布于整个烟草属(Nicotiana)[19-28]。烟草属种质资源包括普通烟草（N.tabacum）、黄花烟（N.rustica）、野生种和种间杂交种。根据调制模式和工业用途不同，普通烟草又分为烤烟、白肋烟、晒烟和雪茄烟等类型。由于种间生殖隔离，黄花烟和野生种的TMV抗源难以应用于普通烟草育种，黄花烟和部分野生种的TMV抗性与N导入片段无关。因此，本文重点鉴定普通烟草枯斑资源的N导入片段长度。

目前，菲利普·莫里斯公司公开了包含N导入片段的TN90的基因组草图数据[31]，由于尚未组装为可计算物理距离的染色体，利用N基因序列只能调取到大小为40.5 Kb的一个Scaffold（未列出数据）。而和烟草同属于茄科的番茄公开了染色体基因组数据[32]，该番茄基因组11号染色体包含N基因的同源体，番茄11号染色体上N基因同源体两侧的基因具有明确的物理距离。本文N导入片段特异分子标记是根据番茄11号染色体上N基因同源体两侧的共线性基因开发的，标记名称中的数字对应于番茄11号染色体上的物理距离。因此，烟草N导入片段的相对长度以参比番茄11号染色体上标记间的物理距离表示。番茄的基因组大小为0.8 Gb[32]，二倍体烟草祖先种的基因组大小约为2.5 Gb[31]。烟草二倍体祖先种基因组大小为番茄的3倍左右，烟草N导入片段的长度可按照番茄物理距离的3倍粗略估算。

本文鉴定的51份属于Coker176类型的大部分资源为烤烟、白肋烟和雪茄烟，10份属于Xanthi nc 类型的大部分资源为香料烟，只有2份资源属于Samsun NN类型。N导入片段的长度多样性分布与普通烟草抗TMV育种历史吻合。Holmes首先将心叶烟的整条H染色体转育至香料烟Samsoun中[10]。整条心叶烟H染色体导入普通烟草中带来较大的连锁累赘。育种研究人员通过多次回交选择，逐渐将心叶烟H染色体片段缩短，逐渐将较短的N导入片段在烤烟和白肋烟中育种利用。因此，在较古老的香料烟种质资源中保留了较长的N导入片段，而烤烟和白肋烟资源中的N导入片段较短。较早选育的一个抗TMV烤烟品种为1949年登记的Vamorr 48, Vamorr 48的N导入片段属于较短的Coker176类型。从1949年登记的Vamorr 48至最近选育的烤烟和白肋烟品种的N导入片段都属于Coker176类型[33]，可见，在选育出Vamorr 48之后的近65年中，育种研究人员选育了大量抗TMV品种，但未能将Coker176类型的N导入片段缩短。可能原因有两点，一是N导入片段与普通烟草的对应染色体的同源性较低，减数分裂时不容易发生交换，因此，育种过程中发生染色体交换的频率很低[30]。二是烤烟中Coker176类型的N导入片段的连锁累赘表型在田间表现为产量稍低、新鲜叶片外观相对平滑僵硬（木质化woody）[15-16]，累赘表型容易受氮肥、土壤等环境因素影响，在田间难以肉眼观察和测量。因此，即使在育种群体中发生了交换，交换单株也难以被挑选出来。

根据N导入片段交换频率低和累赘表型难以观测的特点，可采用以下策略筛选短N导入片段的育种材料：选择一个Coker176类型的烤烟资源，与优良感病亲本回交，构建包含上千个单株的回交群体，利用N导入片段的分子标记从中筛选N导入片段的交换单株。

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