2016年朝阳区动物诊疗机构犬狂犬病和A型流感的流行病学调查报告

2018-01-05王雅琴张海云唐艳荣张晓梅许东保张长林曹院章

中国畜牧兽医文摘 2017年11期

关键词：朝阳区唾液狂犬病

王雅琴张海云唐艳荣杨荣张晓梅许东保张长林曹院章

（北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，北京 100018）

2016年朝阳区动物诊疗机构犬狂犬病和A型流感的流行病学调查报告

王雅琴张海云*唐艳荣杨荣张晓梅许东保张长林曹院章

（北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，北京 100018）

本文对动物诊疗机构中因不同的原因前来就诊的宠物进行采样调查，针对狂犬病和A-型流感病毒病开展检测活动，动物诊疗机构共计采样84份，应用 V8实时快速荧光PCR检测设备，开展病原学检测，未发现有携带以上两个病毒的宠物犬。

流行病学调查宠物犬狂犬病 A型流感病毒病实时荧光PCR检测

城市生活中，宠物的饲养既是一种精神需求，也是一种生活方式。在人们关注身心健康的同时，不可避免的重视所饲养动物可能引发的人畜共患传染病的可能。世界卫生组织专家委员会认定的人畜共患病中与宠物犬猫有直接或间接关系的有70 多种[1]。国家卫生计生委疾病控制局官方网站发布信息表明，2016年全国共发生人感染狂犬病644例，感染H7N9型禽流感264例。所以，本次调研的目的旨在通过定点诊疗机构中的就诊病例，采集样品，开展涉及狂犬病、A-型流感的实时荧光PCR检测。调查临床病例中可能携带的严重的人畜共患病可能。通过现场调查与实验室检测相结合的方式，动物疫病进行定期定点抽样调查，经对各类资料和数据综合分析、有效评估免疫效果、病原污染程度等技术指标，从而提出防控建议和预测预警。提高宠物饲养带来的健康危害、经济损失以及潜在的风险意识。

本项目的流行病学调查方法采取动物疫病定点流调的方法，结合实验室检测相结合的方式，在朝阳区四个街道中的动物诊疗机构中开展采样，样品采集的时间为2016年1月至12月，样品冷链运输到我中心实验室，进行V8实时荧光PCR检测，相关数据处理。

本项目的实施单位为北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，参加采样的单位分别位于朝阳区南磨房街道、团结湖街道、望京街道、奥运村街道中的动物治疗机构共计四家。同时涉及朝阳区警犬巡防队的警用犬只。

1 材料和方法

1.1 定点调查的原则和范围

1.1.1 定点流调的原则：每个定点的布局考虑到地域、交通、动物饲养量、动物诊疗机构的工作能力以及所采样品充分的代表性。

1.1.2 定点的范围：指针对动物诊疗机构中前来就诊的宠物采样。

1.2 定点调查的内容

（1）开展项目的动物诊疗机构的完整信息调研。

（2）开展宠物样品信息采集，内容包括宠物主人姓名、病例号、宠物年龄、性别、品种、就诊时临床症状、采集样品种类，采样日期。

（3）开展V8实时快速荧光PCR检测，配套专用商品化试剂盒，对狂犬病、A-型流感病毒病进行快速诊断。

2 定点流行病学调查情况

2.1 样品采集及运输要求

2.1.1 样品采集标准：

咽、眼、鼻棉拭子的采集：选择有临床呼吸道症状的犬，采集样品前要求润湿棉签，在黏膜部位捻转3～5次。放置于含有1ml生理盐水的离心管内。

唾液样品的采集：随机选择可以采集唾液的犬，将唾液导入经过高温高压消毒的一次性1.5ml离心管内。2.1.2 样品保存：样品的适当保存是有效检测的关键环节。棉拭子类样品，可置于生理盐水中保存。样品如果在三日内完成检测，均可以再4℃冷藏保存，超过3日再做检测的样品，可于-20℃冷冻保存。血液类样品，于-20℃冷冻保存。所有样品都应避免反复冻融。

2.1.3 样品运输：样品要求保持冷链运输。

2.2 试验方法和试剂来源

2.2.1 检测原理：实时荧光PCR检测方法是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过特定探针和引物的设计和合成，模板的制备，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

2.2.2 实验使用仪器：

（1）V8实时荧光PCR检测仪器。特点：快速变温、收集荧光信号、自动设定阈值、自动计算Ct值。

（2）移液器。试验中配备的eppendorf手动单道移液器10μl、20μl、100μl、200μl、1000μl的移液器各一把。

（3）其他设备：配备电热恒温水浴锅一台、小型漩涡振荡器一台，计时器一台，板架若干。

2.2.3 实验使用的V8反应试剂盒。共计引进V8试剂盒10个，其中狂犬病V8反应试剂盒5个，A-型流感V8反应试剂盒5个。

3 检测方法V8实时荧光PCR检测操作步骤

3.1 RNA提取操作

按照试剂盒内操作说明开展提取操作，通过消化--吸附--洗涤--洗脱获得相应的核酸模板。

3.2 核酸扩增反应操作

（1）取V8实时荧光PCR反应管，置于室温融化，放置于反应管架（温度保持在2-10℃），加入核酸模板，用离心机离心30s，放入V8实时荧光PCR检测仪器中，使用对应的反应程序进行扩增反应。

（2）结果判定：根据自动分析，Ct值≤36并出现特定的扩增曲线为阳性样品；Ct值＞36时，并出现特定的扩增曲线，需要重新取样品提取核酸模板，扩增后进行结果判定，如仍出现特定的扩增曲线，结果判定为阳性样品；对于未能呈现特定的“s”型曲线的，即使Ct值≤36，应为阴性。

3.3 注意事项

3.3.1 预防污染

操作人员必须穿戴好工作服、口罩、手套；提取过程中，尽量避免手套接触吸附柱管口和离心管管口；将液体吸入吸附柱中时，若离心管开盖时液体粘在手上或溅出，应立即更换手套；

所有用于检测的废弃物都应该收集放入消毒液的消毒缸中。

反应管放入仪器前，一定要盖紧封口，放置在仪器内崩开。实验结束后，用卡夹取出时，要卡到反应管最后一道棱框内，放置取出过程中导致封口崩开，飞沫污染仪器。

实验结束后，应该用1%次氯酸钠或75%酒精消毒工作台。

3.3.2 规范操作

所有样品必须进行明确的标记，编号，采样单位制作完整的《V8项目检测样品采样表格》，送样品时上交《V8项目流行病学调查采样登记表》。由实验室进行检测号码的编制，并且进行标记，排序。

所有样品都需进行充分的融化后进行检测，棉拭子以及唾液样品检测前需要进行振荡混匀。严禁样品反复冻融（三次不可用）。

实际操作中，所有试剂使用前需要认真核对检测试剂名称。反应管、蛋白酶K使用前，于室温融化，随用随取，用后立即放回冰箱。

所有实验操作完全按照操作说明书步骤操作，不得删减。

3.4 仪器设备计量、效验、维护

参加由北京世纪元亨组织的V8快速实时荧光PCR能力验证比对实验，依据ISO/IEC17043、GB/T 27043和SN/T2989运作能力验证计划，参与能力验证比对实验。实验结果：比对实验中的四个盲样，检测结果均为满意。计算中位值、标准IQR和Z比分数，均为满意。

3.5 影响调查研究结果和数据的条件和因素

3.5.1 样品采集的代表性意义：动物流行病学调查采样工作，采样人员的主观因素影响比较严重，随机性差，不具有完全的代表性。同时，也与动物诊疗机构工作状况相关，在日常工作比较繁忙的季节，采样数量明显较少。存在样品采集的随机误差和选择偏倚。

3.5.2 检测水平和检测方法效验误差：V8实时荧光PCR检测系统虽然是成熟的检测技术，但是在实际操作过程中，对操作人员的要求较高，对各种试剂的存储、使用都有着极为苛刻的规定，不可避免出现人员误差和仪器误差。

3.5.3 项目设计中的目的性偏倚：本项目的主旨是宠物源性人畜共患病的快速诊断检测的应用，针对个体动物的疫病携带情况的检测和分析，缺少对整个群体的大数据分析和考量。所以，检测范围小、采集样品量少、实验数据少，社会意义有限。

4 结果

2016年1月至12月期间我实验室共计接收到动物诊疗机构送检样品84份，犬唾液样品50份，咽、眼、鼻棉拭子34份。共计开展实时荧光PCR检测86项次，其中狂犬病检测50项次、A-型流感检测36项次。

4.1 狂犬病调查结果

共计收到50份犬唾液样品，根据样品的要求，46份犬唾液样符合实验要求，46份样品检测结果均为阴性。

4.2 A-型流感调查结果

共计开展犬咽、眼、鼻棉拭子34份A-型流感检测，结果均为阴性。

5 结论

在2016年1月至12月期间，在朝阳区的四个街道的诊疗机构中采集的就诊动物样品的检测中，其中病毒类传染病狂犬病未检出，A-型流感病毒病未检出；

6 分析与讨论

6.1 狂犬病检测情况分析

根据我国2000年以后狂犬病的死亡人数变化可以看出，自2007年以后，死亡人数持续下降。以2015年为例，截至2015年8月份，北京市报告本地狂犬病8例，发病率0.06/10万，病死率100%。根据网络数据2015年1～8月全市动物致伤120241人次，比2014年同期上升11.4%[2]。在政府大力度宣传、全面开展门诊狂犬病疫苗接种等工作的背景下，家庭饲养的犬只，开展狂犬病免疫的比例较大。加之北京市狂犬病强制免疫政策和注册犬免费免疫政策的实施以朝阳区为例，多年来能够保证注册犬的100%免疫。最重要的是在就诊病例中，动物主人对待动物的态度和关注度都远远高于一般动物饲养者，所以，未检出狂犬病病毒携带符合社会现状。

关于犬唾液检测的说明：唾液检测狂犬病用于人类的狂犬病检测方法。犬的唾液中发现的狂犬病病毒，是在多克隆的免疫球蛋白的乳胶凝聚中发现的。唾液中的病毒检出低于直接从脑组织中检测出来，唾液的阴性检测仍然需要直接的脑组织检测来验证。更加敏感和特异性的唾液检测需要进一步的病毒分离和基因检测方法[4]。也就是说，犬唾液的检测是可以检测出狂犬病病原体的，但是易发生假阴性，如果需要进行确定的诊断仍需要进行脑组织的检测，所以犬唾液检测具有一定的局限性。

6.2 A型流感病毒病情况分析

A型流感病毒属于是正粘病毒科，其最危险的特性是跨种间传播，A型流感已经在多种动物中分离到：如人、禽类、猪、马、猫、犬等。其中流感病毒受体在犬体内分布最为广泛，可以作为流感病毒的中间宿主，使得病毒在体内进行重组，从而产生新的病毒威胁人类的生命安全[3]。根据A-型流感在犬类上的报道，犬猫的A型流感携带是由于人类感染，导致所饲养动物出现携带。根据2009年犬携带H3N8和国内关于犬携带H1N1的报道，都没有明确的证据证明犬所携带的A-型流感病毒可以感染人类[4]。由于A-型流感病毒的复杂情况，应该在尽可能多的环节，增加检测动物品种和数量，尽可能地在最早的时刻，将流感的携带动物及时筛查出来。本次检测采集样品数量有限，对现实情况的指导意义有限。