GM试验联合CD4+T淋巴细胞诊断艾滋病患者侵袭性曲霉病的研究

柳明波,方 霞,梁 欣,李锡燕

(广西医科大学第十附属医院/钦州市第一人民医院，广西 钦州 535000)

·论著·

GM试验联合CD4+T淋巴细胞诊断艾滋病患者侵袭性曲霉病的研究

柳明波,方 霞,梁 欣,李锡燕

(广西医科大学第十附属医院/钦州市第一人民医院，广西 钦州 535000)

目的探讨半乳甘露聚糖(GM)试验联合CD4+T淋巴细胞检测对艾滋病(AIDS)患者合并侵袭性曲霉菌病(IA)的早期诊断价值。方法回顾性分析2014年1月—2016年12月某院住院怀疑IA的AIDS患者197例，分为确诊IA组(35例)、临床诊断IA组(疑似病例,96例)和非IA组(66例)，比较GM试验、GM试验联合CD4+T淋巴细胞计数检测诊断IA的灵敏度和特异度。结果确诊IA组、临床诊断IA组、非IA组患者GM值中位数(最小值，最大值)分别为1.29(0.65，1.84)、0.91(0.36，1.23)、0.11(0.28，0.72)pg/mL，CD4+T淋巴细胞计数分别为45(29，69)、79(35，99)、89(59，158)cell/μL，三组患者GM值和CD4+T淋巴细胞计数比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。单独GM试验诊断AIDS患者IA的灵敏度为64.9%，特异度为72.7%；1周内连续2次GM试验诊断AIDS患者IA的灵敏度为72.5%，特异度为95.5%；GM试验和CD4+T淋巴细胞联合检测的灵敏度为86.3%，特异度为90.9%。结论GM试验对AIDS 患者IA有较好的诊断价值，且连续行GM试验、GM试验联合CD4+T淋巴细胞计数检测将进一步提高IA临床诊断价值。

半乳甘露聚糖； CD4+T淋巴细胞； 艾滋病； 侵袭性曲霉菌病

侵袭性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)是人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染者/艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)患者最常见的机会感染，严重时可导致患者死亡[1-2]。IFI在AIDS患者中的发病率和病死率均较高，分别为41.2%、22.9%[3-4]。HIV感染可以影响患者的细胞免疫功能使其发生异常，从而使患者免疫功能低下而引起一系列机会性感染和肿瘤的发生[5-6]。机会性感染是导致晚期AIDS患者死亡的最重要原因，其中IFI所导致的机会感染占较高比例[7]。研究显示，半乳甘露聚糖(galactomannan, GM)试验有诊断恶性血液病等患者侵袭性曲霉菌病(invasive aspergillosis, IA)的价值，但在AIDS患者中的相关报道较少；有研究显示CD4+T淋巴细胞检测对诊断AIDS患者侵袭性曲霉菌病有一定价值[8-9]。因此，本研究对GM试验和CD4+T淋巴细胞检测诊断IA的价值进行分析评价，旨在评价GM试验联合CD4+T淋巴细胞检测在诊断AIDS患者IA的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析2014年1月—2016年12月钦州市第一人民医院感染科怀疑IA的AIDS住院患者197例，男性88例，女性109例，年龄17～69岁。研究纳入标准：(1)感染科住院HIV/AIDS患者；(2)抗菌药物应用时间>10 d，或伴发热；(3)患者行GM试验和CD4+T淋巴细胞计数检测。根据IA的诊断标准将患者分三组，分别为确诊IA组(35例)、临床诊断IA组(疑似病例，96例)和非IA组(66例)，且治疗前同时行GM试验和CD4+T淋巴细胞计数。三组患者在性别、年龄方面比较差异无统计学意义(均P>0.05)。AIDS诊断标准：依据1993年美国疾病控制与预防中心(CDC) 发布的AIDS诊断标准, 抗-HIV阳性，并由钦州市疾病预防控制中心以免疫印迹法确诊试验阳性。IA的诊断标准[10]：(1)确诊：通过组织病理学检查发现曲霉菌或无菌组织培养发现曲霉菌；(2)临床诊断：有IA宿主/环境因素、临床及影像学表现，而无微生物学依据。

1.2 方法

1.2.1 真菌培养及鉴定 采用法国生物梅里埃VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统及其配套试剂进行真菌鉴定。将患者血、胸腹腔积液、深部咳出的痰以及其他深部组织液进行真菌培养，培养阳性标本的菌落接种于沙氏琼脂培养基，然后根据菌落生长、颜色、形态等特征，结合镜检菌丝或孢子的形态确定菌种。

1.2.2 GM试验检测 采集患者入院后晨起空腹静脉血3 mL，以1 000 r/min 离心10 min，留取上清液200 μL于-20℃保存；然后于一周内再次采集患者静脉血取血清保存后待检测。操作步骤依据曲霉菌GM检测试剂盒[丹娜(天津)生物科技有限公司提供]说明书进行，并使用全自动酶联测定仪进行测定。参照美国食品药品监督管理局(FDA)建议cut-off = 0.5为界定值，依据曲霉菌阳性判断标准[11]：连续两次GM>0.5或单次>1.0均为阳性。

1.2.3 CD4+T淋巴细胞计数检测 抽取抗凝静脉血3 mL立即送检，应用FACSCanto II流式细胞仪[碧迪医疗器械(上海)有限公司提供]检测CD4+T淋巴细胞绝对数(cell/μL)，CD4+<50 cell/μL判定为阳性。6色TBNK试剂盒和FACS溶血素均购自美国BD公司。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0软件进行统计分析，非正态分布资料以中位数(最小值，最大值)表示，多组非正态分布资料总体比较采用Kruskal-Wallis秩和检验或H检验，检验统计量为H，多组两两比较采用Wilcoxon秩和检验，检验统计量为T。采用敏感度、特异度评价GM试验相关指标的诊断水平，率的比较采用χ2检验,进行受试者特征工作曲线(ROC曲线)分析。

2 结果

2.1 三组患者基本情况 确诊IA组、临床诊断IA组发热患者均>80%，100%有咳嗽、咳痰症状，出现影像学改变者分别占88.57%、96.88%。确诊IA组54.29%痰涂片阳性，77.15%痰培养阳性，34.29%灌洗液培养阳性。各组临床表现及检查结果见表1。

表1197例AIDS患者各组临床表现及检查结果[例(%)]

Table1Clinical manifestations and detection results of each groups of 197 AIDS patients(No. of cases[%])

分组确诊IA组(n=35)临床诊断IA组(n=96)非IA组(n=66)发热29(82．86)87(90．63)16(24．24)咳嗽、咳痰35(100．00)96(100．00)7(10．61)支气管扩张11(31．43)24(25．00)0(0．00)白细胞<3．5×109/L18(51．43)56(58．33)2(3．03)血小板<50×109/L15(42．86)49(51．04)2(3．03)CT影像学改变∗31(88．57)93(96．88)0(0．00)结核感染病史12(34．29)25(26．04)3(4．55)曲霉菌阳性 病理学检查1(2．86)0(0．00)0(0．00) 痰涂片19(54．29)3(3．13)0(0．00) 痰培养27(77．15)0(0．00)0(0．00) 灌洗液培养12(34．29)0(0．00)0(0．00) 血培养6(17．14)0(0．00)0(0．00)

*: 肺部空洞伴或不伴曲霉肿块、浸润、结节和各种程度的肺或胸膜纤维化

2.2 GM值与CD4+T淋巴细胞计数比较 三组患者GM值和CD4+T淋巴细胞计数比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。三组数值两两比较，确诊IA组的GM值高于非IA组，CD4+T淋巴细胞计数低于非IA组(均P<0.05)；临床诊断IA组GM值高于非IA组(P<0.05)，而CD4+T淋巴细胞计数两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；确诊IA组与临床诊断IA组的GM值和CD4+T淋巴细胞计数比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2三组AIDS患者GM值与CD4+T淋巴细胞计数比较[中位数 (最小值, 最大值) ]

Table2Comparison of GM value and CD4+T lymphocyte counting among three groups of AIDS patients (medium [minimum, maximum])

组别GM值(pg/mL)CD4+T淋巴细胞计数(cell/μL)确诊IA组(n=35)1．29(0．65，1．84)45(29，69)临床诊断IA组(n=96)0．91(0．36，1．23)79(35，99)非IA组(n=66)0．11(0．28，0．72)89(59，158)H53．7422．67P0．000．00

2.3 GM试验和CD4+T淋巴细胞计数对AIDS患者IA的诊断能力

2.3.1 单次GM试验 单次GM试验诊断AIDS患者IA(包括确诊与临床诊断)的灵敏度为64.9%，特异度为72.7%。见表3。

2.3.2 连续2次GM试验 1周连续2次进行GM试验诊断AIDS患者IA的灵敏度为72.5%，特异度为95.5%，高于单次检测GM试验的特异度(均P<0.05)。见表3。

2.3.3 单次GM试验联合CD4+T淋巴细胞检测 单次GM试验联合CD4+T淋巴细胞检测诊断AIDS患者IA的灵敏度为86.3%，特异度为90.9%，高于单次检测GM值的灵敏度和特异度(均P<0.05)。见表3。

表3 GM试验和CD4+T淋巴细胞计数对AIDS患者IA的诊断效能

2.3.4 三种检测方法诊断AIDS患者IA的ROC曲线 单次GM试验、连续2次GM试验，以及单次GM试验联合CD4+T淋巴细胞检测对AIDS患者IA的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.713(95%CI：0.581～0.844)、0.905(95%CI：0.825～0.985)和0.930(95%CI：0.895～1.002)。见图1。

图1 三种检测方法诊断AIDS患者IA的ROC曲线

Figure1ROC curve of three detection methods for daignosing IA in patients with AIDS

3 讨论

目前，在IFI诊断研究中，非培养诊断方法是国内外学者关注的热点。主要的诊断方法有两种，一种是血清学方法，基于免疫学原理；另一种是分子生物学方法，以聚合酶链式反应(PCR)技术为基础[12-13]。两种方法都有各自的优点和缺点，血清学方法具有较高的敏感性和特异性，技术发展相对成熟，但缺点是会产生假阳性、假阴性等问题，这主要是由于免疫学原理的属性所导致的结果。分子生物学方法的优点是特异性高，缺点主要是样本采集及检测过程相对复杂，相关的检测技术尚未完全发展成熟[14]。目前，IA检查诊断方法主要有：(1)影像学检查，通过CT检查的特征性改变辅助诊断；(2)光学显微镜下的病原学检查；(3)血清学方法包括GM试验和β-1,3-D-葡聚糖试验(β-1,3-D-glucan, BDG, G试验)；(4)PCR检测曲霉菌细胞核物质[15]。

GM试验已经被欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组和美国国立变态反应和感染病研究院真菌病研究共识组(EORTC/MSG)认定为临床诊断IFI中IA的微生物学诊断标准，并推荐对高危成人患者进行常规检测，每周检测2次，诊断标准为成人如果连续2次>0.5判定为阳性；儿童患者连续2次>0.8或单次>1.5为阳性标准[16-17]。本研究结果显示，GM试验单次检测灵敏度较低(64.9%)，而特异性(72.7%)尚可；1周内连续2次行GM试验检测可以提高灵敏度和特异度，分别为72.5%、95.5%。单次GM试验假阳性率为27.3%(18/66)，表明GM试验在诊断AIDS患者IA中有较高的假阳性率，可能与患者接受了抗菌药物治疗有关，如β-内酰胺酶、氨苄西林、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸等抗菌药物均可导致假阳性，其中有1例新生隐球菌感染GM试验结果为阳性。因此，进行GM试验时要注意避免假阳性或注意分析假阳性相关的影响因素。本组研究结果表明，单次检测假阴性率较高(35.1%)，而连续2次进行GM试验检测可以降低假阴性率(27.5%)，可能与曲霉菌细胞壁多糖成分释放和检测灵敏度有关，说明可以通过连续进行GM试验，提高诊断的特异性。

目前，尚未见关于GM 试验联合CD4+T淋巴细胞计数检测对AIDS患者合并IA诊断价值的相关报道。研究[18]报道，CD4+T淋巴细胞计数与AIDS机会感染出现的频率有一定关系，CD4+T淋巴细胞下降时AIDS患者也容易发生其他机会感染，因此，需要与GM试验联合检测进行诊断。GM试验联合CD4+T淋巴细胞检测诊断IA的灵敏度为86.3%，特异度为90.9%，可以明显提高诊断准确率。本研究中IA病例包括确诊IA病例与临床诊断IA病例，对诊断能力的评价可能有一定影响；临床诊断IA病例均有曲霉菌CT影像学特征改变，并且给予抗真菌治疗后有效，因此，保证了总体评价的准确性。另一方面，本研究如果能进一步分析GM试验不同折点对AIDS患者IA的诊断效能，对IA患者的诊断具有重要临床意义。

本研究结果显示，CD4+T淋巴细胞联合GM试验的诊断灵敏度相对较高，而连续2次GM试验的诊断特异度更高，临床医生应该根据临床情况采取相应的诊断策略，早期诊断IA。

综上所述，GM试验对AIDS患者IA具有较好的诊断价值，且连续监测及联合CD4+T淋巴细胞计数可以提高临床诊断价值。

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GalactomannantestcombinedwithCD4+TlymphocytesforthediagnosisofinvasiveaspergillosisinpatientswithAIDS

LIUMing-bo,FANGXia,LIANGXin,LIXi-yan

(QinzhouFirstPeople’sHospitalandtheTenthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Qinzhou535000,China)

ObjectiveTo evaluate the effect of galactomannan(GM) test combined with CD4+T lymphocyte detection on early diagnosis of invasive aspergillosis (IA) in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS).Methods197 AIDS patients who were suspected with IA in a hospital from January 2014 to December 2016 were analyzed retrospectively, they were divided into confirmed IA group (n=35), clinically diagnosed IA group (n=96, suspected cases), and non-IA group(n=66), sensitivity and specificity of GM test and GM test combined CD4+T lymphocyte counting for diagnosing IA were compared.ResultsIn confirmed IA group, clinically diagnosed IA group, and non-IA group, the medium values of GM (minimum, maximum) were 1.29(0.65，1.84)pg /mL, 0.91(0.36，1.23)pg /mL, and 0.11(0.28，0.72)pg /mL respectively, CD4+T lymphocyte counting were 45(29，69)cells/μL, 79(35，99)cells/μL, and 89(59，158)cells/μL respectively, GM value and CD4+T lymphocyte counting among three groups were significantly different(allP<0.05). The sensitivity and specificity of single GM test for diagnosing IA in AIDS patients were 64.9% and 72.7% respectively; sensitivity and specificity of two consecutive GM test within one week for diagnosing IA were 72.5% and 95.5% respectively; sensitivity and specificity of GM test combined CD4+T lymphocyte counting were 86.3% and 90.9% respectively.ConclusionGM test has better diagnostic value for IA in AIDS patients, continuous GM test and GM test combined CD4+T lymphocyte counting will further improve the clinical diagnostic value for IA.

galactomannan; CD4+T lymphocyte; acquired immunodeficiency syndrome; invasive aspergillosis

[Chin J Infect Control，2018，17(1)：36-40]

2017-04-10

广西壮族自治区卫生厅自筹青年基金(Z2013746)；广西医科大学青年科学基金(GXMUYSF201347)

柳明波(1979-)，男(汉族)，湖北省咸宁市人，主管技师，主要从事微生物检验及分子生物学研究。

柳明波 E-mail: mingabo@126.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2018.01.008

R519

A

1671-9638(2018)01-0036-05

孟秀娟、左双燕)