通心络干预肥大细胞脱颗粒诱导的炎症反应对缺血再灌注心肌的保护机制

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通心络干预肥大细胞脱颗粒诱导的炎症反应对缺血再灌注心肌的保护机制

黄婷1，2，李绍旦2，李涵2，张俊修2，高路2，刘毅2，杨明会2

目的探讨通心络干预肥大细胞脱颗粒诱导的炎症反应对缺血再灌注模型大鼠心肌损伤的保护机制。方法将36只健康成年雄性SD大鼠随机分成假手术组、模型组和通心络组。通过可逆性左冠状动脉前降支结扎法建立心肌缺血再灌注模型，大鼠心肌缺血1h，再灌注2h；假手术组仅穿线不结扎。通心络组大鼠予通心络灌胃，假手术组和模型组给予等量的生理盐水灌胃。1周后，免疫组化法检测心肌标本类胰蛋白酶(TPS)、c-Fos和组胺(Histamine)；Elisa法检测血清TPS和c-Fos及TUNEL凋亡指数等指标。结果通心络组大鼠的心肌凋亡指数和TPS、c-Fos、组胺表达水平较模型组均明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论通心络可抑制心肌细胞凋亡，并通过降低血清TPS和c-Fos及组胺表达水平，抑制肥大细胞脱颗粒诱导的炎症反应，保护受损心肌。

心肌缺血再灌注；通心络；肥大细胞脱颗粒；炎症反应；类胰蛋白酶；c-Fos；组胺

在冠脉缺血基础上恢复血流，组织细胞损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤现象称为心肌缺血再灌注损伤(MIRI)，减轻心肌组织微血管损伤是临床研究难题。我国古代医学文献中无心肌缺血再灌注损伤这一病名，根据其病位和临床表现，应属于“胸痹”“心痛”“心悸”范畴。

中药复方通心络以吴以岭院士“由络以通、交会生化”的络病理论为指导[1]，以全蝎、蜈蚣、蝉蜕搜积通络，水蛭、土鳖虫剔除络瘀，桂枝、薤白、降香疏络畅气，人参、黄芪补气通络，全方渗灌气血、濡养代谢[2]。本研究从模型大鼠心肌凋亡程度及肥大细胞脱颗粒诱导的炎症反应等方面，探讨通心络对受损心肌的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠36只[购自军事医学科学院动物中心，许可证号：SCXK-(军)2012-0004]，体质量240g±20g，每笼5只饲养于独立通气笼具系统内。温度22 ℃±1 ℃，湿度(50±5)%，每日光照与黑夜时间各12h。实验期间造模、取材等操作均在超净工作台内进行，添加饲料、换水、灌药等由专人负责管理。

1.2 主要药物及试剂 通心络超微粉(石家庄以岭药业股份有限公司，批号：SY1605001)；乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司，批号：T2011110 )；4%多聚甲醛(盛生物技术有限责任公司，批号AR-0211)；TUNEL凋亡检测试剂盒(美国ROCHE公司，POD：11684817910)；c-fosELISA检测试剂盒(上海乔羽生物科技有限公司，批号：YM-R30032)；类胰蛋白酶(TPS)ELISA检测试剂盒(上海乔羽生物科技有限公司，批号：YM-R2019)；一抗类胰蛋白酶(ABCAM公司产品，批号：ab151757)；一抗c-fos(ABCAM公司产品，批号：ab190289)；一抗组胺(北京博奥森，批号：bs-2325R)；兔二抗(北京中杉金桥，批号：sp-9001)；DAB显色剂(北京中杉产品，批号：ZLI-9032)

1.3 主要仪器 超净工作台(北京长城空气净化工程公司)；电子秤(长沙湘平科技发展有限公司，EPS2001)；小动物心电图机(北京福田电子医疗仪器有限公司，FX211)；动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司，ALC-V9)；高速离心机(PerkinElmerVICTORX5)；MultiskanMK3 酶标仪(ThermoFisherScientific公司)；显微镜(日本奥林巴斯，BX51T-PHD-J11)；多功能真彩色细胞图像分析管理系统(美国MediaCybernetics公司，Image-ProPlus6.0)；切片机(德国徕卡RM2016)；移液器(德国EPPENDORF)；干燥箱(日本三洋MIR-153型)

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组及给药 选取心电图正常大鼠36只，采用随机数字表法分成假手术组、模型组和通心络组，每组12只。通心络组大鼠予通心络超微粉以1.0g/(kg·d)并溶于生理盐水2mL灌胃，假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃，连续灌胃1周。

1.4.2 大鼠缺血再灌注模型制备 心肌缺血再灌注模型参考文献[3]。大鼠以5mL/kg腹腔注射20%乌拉坦麻醉后，采用面罩覆盖口鼻连接呼吸机，设定呼吸频率80次/min、潮气量15mL/kg、呼吸比1∶1，胸部备皮、碘附消毒。于大鼠左侧胸壁3肋～4肋间纵向切开皮肤约2cm，止血钳钝性分离，开胸，暴露心脏，剥离心包膜，在肺动脉圆锥与左心耳之间，左心耳下缘约2mm～3mm处结扎，冠脉与结扎线之间使用5号白线隔开(假手术组只穿线，不结扎)，进针深度1mm～1.5mm，宽约2.0mm，使用弯止血钳将胸部皮肤和肌肉夹紧关闭胸腔，呼吸机维持10min～15min，待大鼠自主呼吸恢复观察心电图改变。造模成功标志：室壁运动减弱，结扎下部心肌组织颜色变白，心电图可见胸前各个导联ST段抬高、T波高耸。冠脉结扎1h后，连接呼吸机，逐层打开胸腔，松开结扎线，完成再灌注[4]。

1.4.3 实验指标检测与标本处理 大鼠再灌注2h后，采集心电图，腹主动脉取血5mL，摘取心脏，予4%多聚甲醛保存。采用免疫组化法检测类胰蛋白酶(tryptase，TPS)、c-Fos和组胺水平，将心肌标本固定、包埋、显色、显微镜观察，选择实验组和对照组阳性组织相进行400×显微照相，图像分析；根据凋亡检测试剂盒说明书检验凋亡阳性细胞分布情况，于200倍荧光显微镜下，随机选取3个～4个视野，分别计算凋亡指数[凋亡指数=凋亡细胞计数/(凋亡细胞计数+正常细胞计数)×100%]，取平均值。取1mL血标本检测血常规，高速离心机分离血清，检测生化指标；予ELISA试剂盒分别检测血清TPS和c-Fos表达水平。

2 结 果

2.1 大鼠心电图改变 假手术组再灌2h后与造模后比较，部分大鼠心电图肢体导联Ⅱ、Ⅲ、ST段轻度抬高，Ⅱ导联出现病理性Q波。

模型组大鼠心电图肢体导联Ⅱ、ST段有不同程度抬高，肢体导联Ⅲ、T波倒置，部分老鼠再灌注后出现心律失常。通心络组大鼠再灌2h后，部分心电图T波抬高回落约0.06s，QRS波群宽大畸形概率低于模型组，模型组大鼠再灌注后T波回落较少，有些甚至上抬明显。

2.2 3组大鼠凋亡指数比较 通心络组大鼠凋亡指数与假手术组、模型组比较均显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；模型组大鼠凋亡指数较假手术组显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表1。

2.3 3组大鼠TPS、c-Fos和组胺凋亡指数表达水平比较 通心络组大鼠TPS阳性率较模型组显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；模型组大鼠TPS阳性率较假手术组显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。通心络组大鼠c-Fos、组胺阳性率与假手术组、模型组比较均显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；模型组大鼠c-Fos、组胺阳性率较假手术组显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表1，图1。

表1 3组大鼠TPS、c-Fos和组胺凋亡指数表达水平比较(±s) %

注：A为假手术组；B为模型组；C为通心络组。

图1大鼠心肌标本TPS、c-Fos和组胺表达图像(400×)

2.4 3组大鼠血清TPS、c-Fos水平变化比较 与假手术组比较，模型组与通心络组大鼠血清TPS、c-Fos水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；通心络组与模型组比较，大鼠血清TPS、c-Fos水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表2。

表2 3组大鼠血清TPS、c-Fos水平变化比较(±s) mg/mL

3 讨 论

随着现代医学技术的发展，一些动脉搭桥术、溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成形术等应用于心肌缺血的治疗[5]，随之带来MIRI的发生率逐年升高，成为临床治疗的一大难题[6]。心肌缺血再灌注的炎症反应进一步加重心肌损伤[7]，其发病机制倾向于钙超载、氧自由基、炎症反应、能量代谢障碍等[8]，其中肥大细胞脱颗粒介导的炎症反应较为突出。肥大细胞广泛分布在皮肤及内脏黏膜下的微血管周围[9]，血液中的肥大细胞含有肝素、组织胺、5-羟色胺等[10]，肥大细胞分泌颗粒中特有的一种丝氨酸蛋白酶即TPS，仅少量分泌入血，不易检测[11]；当过敏或炎症引起肥大细胞脱颗粒时，则大量进入血液，血清浓度急剧升高。有研究发现，类胰蛋白酶和类糜蛋白酶可通过不同机制促使炎症发生，破坏基底膜的完整性及促进组织的构型重塑；抗原刺激时，膜表面受体活化，使脾酪氨酸激酶Syk和Fyn蛋白酪氨酸激酶活化，形成肥大细胞脱颗粒的初始信号[12]。TPS、c-Fos主要由肥大细胞分泌的炎症介质，经肥大细胞脱颗粒释放到细胞外，因其在肥大细胞的贮存和表达具有高度选择性，故可作为肥大细胞激活及其脱颗粒的标志[13-15]。肥大细胞脱颗粒反应依赖于Ca2+浓度[16]，释放组胺、5-羟色胺等介质，激活炎症反应，破坏胞膜线粒体等微观结构，加重心肌损伤[17]。

中药复方通心络以“络以通为用”治疗原则[18]，运用搜剔疏通类药物，改善微循环；既往课题组研究发现通心络超微粉渗灌气血，濡养脏腑[19]，可保护血管内皮损伤，减轻心肌再灌注损伤，缩小心肌梗死无复流面积，减轻心肌再灌注损伤[20]；通过多途径、多环节、多靶点影响疾病进程，改善心肌受损严重程度和预后[21]。

本研究结果显示，通心络组大鼠心肌组织的凋亡指数，较模型组显著降低近30%，表明通心络超微粉可改善细胞内环境，加强细胞修复功能，进而减轻心肌细胞凋亡；实验证明局部组织炎症反应增加耗氧量，释放毒性分泌物，并向周围部组织蔓延，晚期组织异常增生粘连或硬度，免疫组化法检测和Elisa检测中TPS、c-Fos表达水平在模型组显著升高，通心络组显著降低。既往实验研究表明TPS、c-Fos表达水平与肥大细胞脱颗粒呈正相关[22]，通心络组组胺水平降低，依据肥大细胞脱颗粒和组胺释放介导炎症反应，实验结果显示通心络抑制肥大细胞脱颗粒，减少组胺释放，减少炎症因子浸润，抑制渗出液释放毒素，减轻组织细胞的损坏，及时消除致炎因子，修复受损组织，增加组织代谢和抗击力，进而减轻心肌损伤的炎症反应。

综上所述，通心络超微粉可减轻心肌缺血再灌注过程中肥大细胞脱颗粒介导的炎症反应，保护受损心肌，可指导临床疾病的防治和治疗。

[1] 吴以岭.脉络学说构建及其指导血管病变防治研究[J].中国中西医结合杂志，2017，37(2)：147-148.

[2] 杜海波，邓悦，牟宗毅.冠状动脉微血管病变与络病相关的理论探讨[J].环球中医药，2016，9(6)：705-706.

[3] 成玲俐，吴素华，李志梁，等.大鼠心肌缺血再灌注损伤动物模型的建立与评估[J].中国实验诊断学，2010，8(8)：1163-1165.

[4] 黄婷，李绍旦，杨明会，等.大鼠心肌缺血再灌注实验技巧的经验总结[J].中国比较医学杂志，2017，27(9)：80-82.

[5] 李冀，王秀珍，李在斯，等.中药治疗心肌缺血再灌注损伤的研究进展[J].中医药学报，2015，43(2)：107-109.

[6] 徐盟.心肌缺血再灌注损伤的主要机制与相关药物治疗的研究进展[J].实用药物与临床，2014，17(8)：1052-1056.

[7] 黄婷，杨明会，李绍旦，等.肥大细胞脱颗粒和心肌缺血再灌损伤及通络药物干预的研究进展[J].云南医药杂志，2017，2(2)：62-65.

[8] 江一峰.抑制肥大细胞类胰蛋白酶表达对血管内皮细胞合成、分泌炎症介质的影响[D].上海：复旦大学，2008.

[9] 贺学荣，何川，龚建平.肥大细胞激活机制与变态反应性疾病关系的研究进展[J].重庆医学，2014，43(9)：1139-1141.

[10] 杨岚，李蕾，陈国千.肥大细胞功能和介质释放机制的研究进展[J].国际检验医学杂志，2010，31(8)：834-836.

[11] 郑敬民，尹广，恽时锋，等.糖尿病肾病患者尿液类胰蛋白酶水平检测及其病理意义分析[J].医学研究生学报，2014，27(11)：1176-1179.

[12] 邹丽，李欣，高金燕，等.I型超敏反应中肥大细胞脱颗粒活性物质及其信号通路研究进展[J].食品安全质量检测学报，2015，6(11)：4532-4537.

[13] 李秋婷，赵长青.肥大细胞脱颗粒的神经免疫调控机制研究[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2015，29(12)：1118-1120.

[14 ] 曹燕.肥大细胞脱颗粒对动脉粥样硬化大鼠血清hs-CRP、ox-LDL、MMP-3水平和斑块中MMP-3表达的影响[D].衡阳：南华大学，2013.

[15] 燕红玲，何韶衡.类胰蛋白酶的检测及临床意义[J].医学研究生学报，2009，8(22)：871-874.

[16]PinxterenJA，O’SullivanAJ，LarbiKY，etal.Thirtyyearsofstimulussecretioncoupling：fromCa(2+)toGTPintheregulationofexocytosis[J].Biochimie，2000，82(4)：385-393.

[17] 刘东方.肥大细胞脱颗粒机制研究进展[J].国外医学.临床生物化学与检验学分册，2004，2(25)：137-139.

[18] 杜海波.浅谈络病学[A]//中国工程院医药卫生学部、中华中医药学会、中华医学会、中国中西医结合学会、中国医师协会.络病学基础与临床研究(7)[C].郑州：第七届国络病学大会，2011：3.

[19] 张俊修，霍旺，王朋，等.心之络病“孙络疏失”模型大鼠心肌组织病理变化研究[J].中国中医急症，2014，5(23)：785-787；791.

[20]LiXD，YangYJ，GengYJ，etal.TongxinluoreducesmyocardialnoreflowandischemiareperuflisioninjurybystimulatingthephosphorylationofeNOSviathePKApathway[J].AmericanJournalofPhysiology-HeartandCirculatoryPhysiology，2010，299(4)：H1255-H1261．

[21] 王思颖，李绍旦，刘毅，等.通心络对心肌梗死模型大鼠心肌损伤保护作用及机制的研究[J].环球中医药，2016，6(9)：650-653.

[22] 林青，张慧云，何韶衡.肥大细胞类胰蛋白酶在其相关疾病中作用的研究[J].中国热带医学，2008，8(5)：844-847.

ProtectiveMechanismofTongxinluoCapsuleonInflammatoryResponsesInducedbyDegranulationofMastCellsagainstMyocardialIschemiaReperfusionInjuryinRats

HuangTing，LiShaodan，LiHan，ZhangJunxiu，GaoLu，LiuYi，YangMinghui

BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China；TheGeneralHospitalofthePeople’sLiberationArmy，BeijingChina

YangMinghui(TheGeneralHospitalofthePeople’sLiberationArmy，BeijingChina)

ObjectiveToinvestigatetheeffectofprotectiveeffectandmechanismofTongxinluocapsuleonmyocardialinjuryinducedbymastcellsinratswithischemiareperfusioninjury.MethodsThirty-sixhealthyadultmaleSprague-Dawly(SD)ratswererandomlydividedintoshamoperationgroup，modelgroup，Tongxinluogroup.Myocardialischemiareperfusionmodelwasestablishedbyligationoftheleftanteriordescendingcoronaryartery，ratmyocardialischemia1h，reperfusion2h；whiletheshamgroupwaspuncturedwithoutligation.TheratsinTongxinluogroupwereintragastricadministrationbyTongxinluosuspension，andthemodelgroupandtheshamgroupwereintragastricadministrationbysaline.After1weeks，theexpressionsoftryptase，c-Fos，andhistamineweredetectedbyimmunohistochemistry.ELISAmethodwasusedtodetectserumTPSandc-Fos，andTUNELapoptosisindex.ResultsTheapoptosisindexoftheTongxinluogrouprats，theexpressionsofTryptase，c-Fos，andhistamineweresignificantlylowerthanthoseinthemodelgroup(P<0.01).ConclusionTongxinluocapsulecaninhibittheapoptosisofmyocardialcells，andbyreducingTryptase，c-Fosandhistamine，Inhibitionofinflammatoryresponseinducedbydegranulationofmastcells，reducemyocardialinjury，thusprotectingthemyocardialtissue.

myocardialischemiareperfusion；Tongxinluocapsule；mastcelldegranulation；inflammatoryreaction；tryptase；c-Fos；histamine

国家重点基础研究发展计划(973计划)(No.2012CB518601)

1.北京中医药大学(北京100029)；2.中国人民解放军总医院

杨明会，E-mailymh9651@sina.com

信息：黄婷，李绍旦，李涵，等.通心络干预肥大细胞脱颗粒诱导的炎症反应对缺血再灌注心肌的保护机制J.中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(23)：2973-2976.

R542.2 R289.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.23.009

1672-1349(2017)23-2973-04

2017-07-21)

(本文编辑 薛妮)