一种含D-松醇发酵饮料对2型糖尿病大鼠肝损伤的干预作用

秦程广，高山，孙明哲，崖薷丹，张泽生

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

一种含D-松醇发酵饮料对2型糖尿病大鼠肝损伤的干预作用

秦程广，高山，孙明哲，崖薷丹，张泽生*

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

研究一种含D-松醇功能成分的混合菌种发酵饮料对STZ诱导2型糖尿病大鼠肝损伤的干预作用。通过酿酒酵母和乳酸菌混合发酵含D-松醇的角豆粉（carob powder）提取液，制备一款含D-松醇功能成分的发酵型低糖饮料。采用高脂高糖饲料喂养SD大鼠4周后腹腔注射STZ建立2型糖尿病模型，将实验大鼠分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、发酵饮料低剂量组、发酵饮料高剂量组。灌胃发酵饮料4周后，测定大鼠空腹血糖（FBG）、肝脏指数、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）含量，同时在光镜下观察各组大鼠肝组织细胞病理形态学改变。结果表明：与正常对照组相比，模型对照组大鼠血清中AST、ALT水平极显著性升高（P＜0.01），HE染色显示模型对照组大鼠较正常对照组大鼠肝细胞脂肪变性明显，肝组织结构不清楚，肝细胞排列紊乱。与模型对照组大鼠相比，阳性对照组大鼠及发酵饮料剂量组大鼠血清中AST、ALT水平显著性降低（P＜0.05），HE染色显示阳性对照组和发酵饮料剂量组大鼠较模型对照组大鼠肝细胞脂肪变性明显减少，肝细胞排列基本规则。结论：此含D-松醇发酵饮料对2型糖尿病大鼠的肝损伤有一定的干预作用。

D-松醇；发酵饮料；肝损伤；干预作用

2型糖尿病（type-2 diabetes mellitus，T2DM）是一种以高血糖为主要表现的慢性、复杂性的代谢疾病，常伴胰岛素抵抗、高血脂，其并发症范围广泛[1]。过去人们对糖尿病的聚焦点主要在神经损害、血管损害、肾损害，然而肝脏作为调节血糖最重要的器官，是参与机体糖代谢的重要组织之一，在稳定血液中葡萄糖水平方面起到关键作用，肝功能在糖尿病治疗中的作用正被更多的人关注[2-3]。D-松醇又名右旋肌醇甲醚、甲基肌醇、咳宁醇、三扁豆醇、3-甲基肌醇，是D-手性肌醇3位羟基中的H被甲基取代后的环多醇，属于单糖，广泛存在于豆类植物中[4-5]。已有研究表明[6-7]D-松醇可以降低2型糖尿病小鼠的血糖含量，同时对其肝损伤具有一定的干预作用。

乳酸菌和酵母菌在传统发酵制品中经过长期的自然发酵，已形成了一个稳定的微生态环境，菌种间的相互促进和相互制约控制着产品的风味特点、营养特性。有学者认为酵母菌的代谢产物二氧化碳、丙酮酸或其化合物、丙酸盐、琥珀酸盐能够刺激乳酸菌活动，为乳酸菌提供营养物质，同时提出酵母菌产生的维生素复合物、氨基酸刺激乳酸菌活动的结论[8-11]。

角豆（Ceratonia siliqua L.）因其含有丰富的D-松醇而具有较高价值。本研究以角豆粉（carob powder）为原料，酵母菌和乳酸菌为发酵菌种，通过两种益生菌将原料中的糖利用而保留D-松醇，制备一款含D-松醇功能成分的发酵型低糖饮料，不仅降低了产品的含糖量，发挥益生菌的营养价值，同时又具有降血糖的功效。通过对实验大鼠肝脏中一些生理生化指标的检测，观察肝组织病理结构变化，验证该发酵饮料具有缓解糖尿病大鼠肝损伤的作用，从而为开发含D-松醇的功能性产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

所用动物为清洁级Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠75 只[12]，体重（200±10）g，购自北京大学医学部实验动物中心。

1.2 材料与设备

角豆粉：购于土耳其；实验动物基础饲料：北京维通利华实验动物技术有限公司；罗格列酮：天津老百姓大药房；链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）：美国 Sigma公司；大鼠丙氨酸氨基转移酶（Alanineaminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate transaminase，AST）、肝糖原试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司；血糖试纸：美国lifescan公司；酵母菌、乳酸菌：天津科技大学食品工程与生物技术学院实验室所有。

XS205电子天平：METTLER TOLEDO公司；One-Touch血糖仪：美国强生公司；UV-1800分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；BX53F正置荧光显微镜：日本Olympus公司；GSO RVALL LEGEND MICRO 17R离心机：美国Thermo Fisher公司。

1.3 试验方法

1.3.1 含D-松醇功能成分发酵饮料的制备

将角豆粉在料液比 1∶6（g/mL），温度 60℃，时间2 h，提取2次的条件下制得提取液[13]；将提取液总糖浓度浓缩至 120mg/mL，按 1 ∶1（mL/mL）的比例添加12%的酵母菌和乳酸菌，37℃发酵42 h，离心后取上清液，高温杀菌冷却至室温即为含D-松醇功能成分发酵饮料，其中D-松醇含量为18.1mg/mL。

1.3.2 糖尿病大鼠模型的建立

实验动物始终饲养于洁净级动物房中，恒温[（23±2）℃]、恒湿（70%）条件稳定，并保持12 h明暗交替。75只实验大鼠喂饲基础饲料进行1周适应性饲养后，随机选取15只禁食（不禁水）12 h，测空腹血糖，作为该批次动物基础血糖值。之后随机分笼、标记、称重，分正常对照组（15只）、模型组（60只）。正常对照组喂饲正常饲料，模型组喂饲高脂高糖饲料（高脂高糖饲料配方为：50%基础饲料、20%白砂糖、16%猪油、11%酪蛋白、1%明胶、1%胆固醇、0.5%胆酸盐、0.5%矿物质、0.5%维生素[16]），4周后禁食（不禁水）12 h。将STZ溶解于无菌pH 4.2～4.5、0.1 mol/L的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲溶液中，溶液注射浓度为0.1 g/L。模型组大鼠按体重一次性腹腔注射STZ 30mg/kg，正常对照组则按体重一次性腹腔注射等量缓冲溶液。1周后禁食（不禁水）12 h，测血糖，模型组大鼠血糖值大于16.7 mmol/L的48只大鼠为高血糖造模成功动物[14-15]。

1.3.3 实验动物分组

将48只造模成功大鼠按空腹血糖水平随机分为4组，即模型对照组（C组）、阳性对照组（P组）、低剂量组（DL组）、高剂量组（DH组），每组 12只，组间血糖差异不大于1.1 mmol/L。再选取12只同一批次的正常大鼠作为正常对照组（N组），开始进入实验阶段。期间保证实验动物自由饮水、摄食，每天观察精神状况、活动、饮食、饮水、体毛色泽情况。

实验设计方案如表1所示。

表1 实验设计方案Table 1 Experimental Design for grouping mice

1.3.4 血糖测定实验

每7 d测定血糖值，禁食（不禁水）12 h后尾端静脉取血，用血糖仪测定空腹血糖值。血糖下降率/%=（实验前血糖值-实验后血糖值）/实验前血糖值×100。

1.3.5 肝脏生理生化指标检测

1.3.5.1 脏器指数

脏器指数是指脏器质量与体重的比值。

1.3.5.2 丙氨酸氨基转移酶（ALT）的测定

参照中生北控丙氨酸氨基转移酶试剂盒使用说明书操作进行测定。

测定原理：谷丙转氨酶催化L-丙氨酸的氨基转移，生成丙酮酸。丙酮酸与还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）在乳酸盐脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）的催化下反应生成乳酸和氧化钛烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）。NADH 在 340 nm处有特异吸收峰，其被氧化的速率与血清中ALT的活性成正比，在340 nm处测定NADH下降速率，即可测出ALT活性。

1.3.5.3 天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的测定

参照中生北控丙氨酸氨基转移酶试剂盒使用说明书操作进行测定。

测定原理：谷草转氨酶催化L-天冬氨酸的氨基转移与苹果酸脱氢酶（Malate dehydrogenase，MDH）催化的反应偶联，使NADH氧化成NAD+。NADH在340 nm处有特异吸收峰，其被氧化的速率与血清中的AST的活性成正比，在340 nm处测定NADH下降速率，即可测出AST活性。

1.3.6 肝脏组织切片的病理学观察

1.3.6.1 组织固定

取新鲜肝组织1块（约10 mm×10 mm×2 mm），置于10%中性甲醛中固定，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，制成厚度3 μm切片，苏木素-伊红染色，中性树胶封固。

1.3.6.2 肝细胞观察

肝组织经过石蜡包埋、切片、HE染色之后在正置荧光显微镜下观察肝细胞病理变化，评估发酵饮料是否具有改善2型糖尿病大鼠肝损伤的作用。

1.4 统计学处理

实验数据以“平均值±标准差”（M±SD）表示，运用SPSS软件以t检验进行统计学分析。

2 结果

2.1 含D-松醇发酵饮料对实验大鼠脏器指标的影响

糖尿病患者普遍出现体重下降、身体消瘦的症状，同时肝脏因受损出现水肿的现象[17]，动物内脏器官的重量、形态、色泽和脏器指数是衡量动物健康状况的重要指标。依据脏器重量、脏器指数可大体确定机体病变程度，所以脏器指数是动物实验中常用的基础数据，含D-松醇发酵饮料对实验大鼠脏器指数的影响见表2。

表2 含D-松醇发酵饮料对实验大鼠脏器指标的影响（M±SD，n=10）Table 2 Effects of a fermented beverage enriched D-pinitol on organ index of experimental rat（M±SD，n=10）

从表2可以看出，在体重方面，C组大鼠体重与N组大鼠体重相比极显著性降低（P＜0.01）；给予受试样品后，P组与DH组大鼠体重相对于C组大鼠显著性上升（P＜0.05）。C组大鼠的心脏指数、肝脏指数和肾脏指数相较于N组大鼠均极显著性升高（P＜0.01），说明机体已经受损。给予受试样品后，各组大鼠脏器指数有不同程度的恢复。

2.2 含D-松醇发酵饮料对实验大鼠空腹血糖（FBG）的影响

糖尿病患者最直观的病症是患者的空腹血糖（Fasting billd glucose，FBG）明显升高且长期维持在一个相对较高的水平，给予受试样品干预期间，每周对实验大鼠的空腹血糖值进行测定，实验结果如表3所示。

表3 含D-松醇发酵饮料对实验大鼠空腹血糖的影响（M±SD，n=10）Table 3 Effects of a fermented beverage enriched D-pinitol on FBG of experimental rat（M±SD，n=10）

由表3可知，造模成功后，C组大鼠FBG与N组大鼠相比极显著性升高（P＜0.01）；给予受试样品4周后，与C组大鼠FBG相比，P组大鼠FBG极显著性下降（P＜0.01），血糖下降率为10.4%，DH组大鼠FBG显著性下降（P＜0.05），血糖下降率为8.42%，DL组大鼠血糖下降率为5.36%，但无显著性差异。

2.3 含D-松醇发酵饮料对实验大鼠血清中ALT和AST的影响

转氨酶是肝细胞损伤的敏感标志，因此测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性可反映肝细胞损伤的程度，结果如表4。

表4 含D-松醇发酵饮料对实验大鼠血清中ALT和AST的影响（M±SD，n=10）Table 4 Effects of a fermented beverage enriched D-pinitol on the concentration of ALT and AST in serum of experimental rat（M±SD，n=10）

由表4可知，C组大鼠血清中AST和ALT值与N组相比极显著性升高（P＜0.01）；DL组与C组相比ALT、AST值显著性降低（P＜0.05）；P组和DH组与C组相比较，ALT、AST 值均极显著性下降（P＜0.01）。

2.4 实验大鼠肝细胞形态变化

肝脏组织经过石蜡包埋、切片、固片、HE染色、封片后，在正置荧光显微镜下观察肝细胞形态变化，结果如图1所示。

图1 肝细胞HE染色Fig.1 Hematoxylin-Eosin Staining of liver cell

由图1可知，N组肝细胞形态正常，肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，无变性。C组肝细胞内出现大量大小不一的脂肪空泡即发生脂肪变性，肝小叶结构不清楚，肝索排列紊乱。观察P组、DL组及DH组可知，随着灌胃剂量的增加，大鼠肝脏脂肪变性程度减轻，受损肝细胞数量减少，肝细胞排列逐渐趋于规则，与模型对照组相比，病理症状有明显改善。

3 结论

本实验通过给予实验动物一个高糖高脂的饮食环境，诱导实验动物出现胰岛素抵抗现象，并伴随腹腔注射低剂量STZ溶液损伤部分胰岛β细胞来模拟建立生理、病理改变都接近于人类的2型糖尿病模型。

在美国，肝脏病变是2型糖尿病患者死亡的主要原因之一，2型糖尿病患者肝脏病变的标准死亡率远远高于2型糖尿病患者心血管病变的标准死亡率，2型糖尿病患者肝脏病变包括非酒精性脂肪肝病、肝硬化和肝细胞性肝癌、慢性丙型肝炎、急性肝功能衰竭。糖尿病患者血清AST、ALT的水平高于正常人[18]，这两种转氨酶参与的转氨基反应是机体内氨基酸与蛋白质、脂肪、碳水化合物三者相互转化过程中的重要环节。ALT测定反映肝细胞损伤的灵敏度高于AST，肝损伤较轻时ALT便会释放到血液中且在体内灭活较慢，在肝细胞受损严重时，AST才会释放到血液中。SD大鼠造模后，与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清中AST、ALT的活力极显著性升高，说明大鼠肝细胞已经严重受损，经过4周干预后，阳性对照组和剂量组大鼠血清AST、ALT指标有不同程度的下降，说明罗格列酮和含D-松醇发酵饮料可以改善2型糖尿病大鼠受损的肝细胞。

通过正置荧光显微镜对肝脏切片进行观察发现，模型对照组大鼠肝细胞肿胀程度增大，肝细胞呈弥漫性脂肪变性，胞质内充满大量大小不等的圆形脂滴，肝小叶结构不清，小叶内有炎症细胞浸润，细胞排布紊乱，进一步说明糖尿病会对肝细胞造成损伤，灌胃干预后，阳性对照组和剂量组大鼠肝脏细胞排列恢复规则，肿胀程度减小，脂肪变性现象明显减轻，表明该含D-松醇发酵饮料能减轻2型糖尿病对大鼠肝脏的损伤，可使糖尿病肝脏的脂肪变性得到及时控制，对肝脏具有保护作用。

由此可见，该含D-松醇发酵饮料能够降低患者血糖含量，增强机体抗氧化能力，对糖尿病肝脏损害有一定的保护作用，具体作用机制还有待进一步研究。

[1]王蓉蓉,谢琳,吴晓烨,等.银杏叶提取物对实验性2型糖尿病大鼠肝脏的保护作用[J].中国病理生理杂志,2007,23(3):566-569

[2]Wahren J,Ekberg K.Splanchnic regulation of glucose production[J].Annu Rev Nutr,2007,27:329-345

[3]黄斯瑜,李尔凡.血液标本采集过程对检测结果的影响分析[J].实验与检验医学,2013,3(2):191-192

[4]国家医药管理局中草药情报中心站,植物药有效成分手册[M].北京:人民卫生出版社,1986,835

[5]Liu S C,Chuang S M,Tang C H.D-pinitol inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis[J].International Immunopharmacology,2012,12:494-500

[6]张泽生,高云峰,张梦娜,等.D-松醇复配Mn2+对糖尿病ICR小鼠降血糖作用的研究[J].中国食品添加剂,2015(5):55-60

[7]张泽生,秦程广,李雨蒙.D-松醇对STZ诱导2型糖尿病小鼠肝损伤的干预作用[J].中国食品添加剂,2016(12):109-114

[8]VILJOEN B C.The Interaction between Yeasts and Bacteria in Dairy Environments[J].Int J Food Microbiology,2001,69:37-44

[9]ADDIS E,FLEET G H,COX J M,et al.The Growth Properties and Interactions of Yeasts and Bacteria Associated with the Maturation of Camembert and Blue-Veined Cheeses[J].Int J Food Microbiology,2001,69:25-36

[10]Leroi F,Pidoux M.Detection of interactions between yeasts and lactic acid bacteria isolated from sugary kefir grains[J].Journal of Applied Microbiology,2008,74(1):48-53

[11]Roostita R,Fleet G H.The occurrence and growth of yeasts in Camembertandblue-veinedcheeses[J].InternationalJournal of Food Microbiology,1996,28(3):393-404

[12]张泽生,董硕,高云峰,等.肌醇、D-手性肌醇对大鼠酒精性脂肪肝作用的研究[J].中国食品添加剂,2014(9):85-90

[13]张泽生,秦程广,高云峰,等.响应面法优化角豆中D-松醇的提取工艺[J].中国食品添加剂,2016(10):154-159

[14]P K M AnuGeethan,P StanelyMainzen Prince.Antihyperlipidemic Effect of D-Pinitol on Streptozotocin-Induced Diabetic WistarRats[J].Biochem Molecular Toxicology,2008,22(4):220-224

[15]王春田,王莉,石岩.二型糖尿病动物模型制备方法探讨[J].实用中医内科杂志,2011,25(4):27-30

[16]张泽生,张梦娜,高云峰,等.D-松醇对二型糖尿病大鼠PI3K及下游糖原合成基因的调控[J].中国食品添加剂,2015(9):58-65

[17]柴思佳,邓翀,董媛媛.南五味子对2型糖尿病大鼠肝脏保护作用的研究[J].中南药学,2014(8):758-761

[18]Forlani G,Di B P,Mannucci E,et al.Prevalence of elevated liver enzymes in type 2 diabetes mellitus and its association with the metabolic syndrome[J].Endocrinol Invest,2008,31:146-152

Intervention Effect of A Fermented Beverage Enriched D-pinitol on Liver Damage of Type 2 Diabetic Rat

QIN Cheng-guang，GAO Shan，SUN Ming-zhe，AI Ru-dan，ZHANG Ze-sheng*
（Institute of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

This experiment studied the intervention effect of a fermented beverage enriched D-pinitol on liver damage of STZ-induced type 2 diabetic rat.To develop a fermented beverage which was low sugar，the fermentation of Saccharomyces cerevisiae and lactic acid bacteria with the carob powder extract enriched D-pinitol was been stuied.The type 2 diabetic rat were fed enrich-food for 4 weeks before administrated STZ，the SD rats were divided into normal control group，model control group，positive control group，low dose of fermented beverage enriched D-pinitol，high dose of fermented beverage enriched D-pinitol.After 4 weeks of a daily dose of the fermented beverage enriched D-pinitol，some biochemical parameters were measured，which includes FBG，the liver index，ALT，AST test and the pathology morphology change of rat liver tissue cell under research microscope.The Results showed that：Compared with normal control group，the serum AST，ALT level increased extremely significantly（P＜0.01），HE staining showed hepatocyte steatosis significantly in model control group rat，liver tissue structure was not clear，the arrangement of liver cell was disordered.Compared with model control group，the serum AST，ALT level decreased significantly（P＜0.05），HE staining showed liver steatosis decreased significantly in positive control group and dose group，the arrangement of liver cell was well-regulated.The fermented beverage enriched D-pinitol has the positive intervention effect on liver damage of type 2 diabetic rat.

D-pinitol；fermented beverage；liver damage；intervention effect

秦程广，高山，孙明哲，等.一种含D-松醇发酵饮料对2型糖尿病大鼠肝损伤的干预作用[J].食品研究与开发，2018，39（1）：157-161

QIN Chengguang,GAO Shan,SUN Mingzhe，et al.Intervention Effect of A Fermented Beverage Enriched D-pinitol on Liver Damage of Type 2 Diabetic Rat[J].Food Research and Development，2018，39（1）：157-161

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.031

秦程广（1992—），男（汉），硕士研究生，研究方向：食品添加剂与功能配料。

*通信作者：张泽生（1956—），男（汉），教授，博士，研究方向：天然产物活性成分。

2017-05-31