超高效液相质谱法测定人肝细胞中L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和尿素含量

陈澄，王洪梅，李小童，陶怡，张旭敏

（1.上海药明康德新药开发有限公司生物分析部，上海 200131；2.复旦大学生命科学学院，上海 200433）

超高效液相质谱法测定人肝细胞中L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和尿素含量

陈澄1,2，王洪梅1，李小童1，陶怡1，张旭敏2

（1.上海药明康德新药开发有限公司生物分析部，上海 200131；2.复旦大学生命科学学院，上海 200433）

为测定人肝细胞鸟氨酸循环中L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸及尿素的含量，建立了该超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的分析方法。本方法采用ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱，用0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液作为流动相，色谱分离后直接进串联质谱，采用电喷雾离子源，正离子多反应监测模式进行检测。由于人肝细胞中含有大量的被测物质，故本方法采用水作为替代基质进行检测，经验证，该方法有效、可靠，符合方法学的各项验证结果。

L-精氨酸；L-鸟氨酸；L-瓜氨酸；尿素；鸟氨酸循环；肝细胞

近年来，有较多关于检测精氨酸及相关代谢途径的物质的报道[1]。在分析方法上，有通过加入衍生剂对精氨酸等目标化合物进行衍生后用反相色谱的方法进行分析测定[2]，也有用亲水作用色谱柱对其进行保留分离分析[3]，但在这些成分测定中，尿素一直未被关注。在检测基质上，大部分报道都集中在人和动物的血浆中，也有一些是测定内皮细胞等其他生物样本，关于肝细胞中这些组分的测定，从未见报道。本文旨在建立一个UPLC-MS/MS检测方法，同时测定人肝细胞中的L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和尿素的含量，可以直观地看到这些物质含量的变化。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters UPLC（新加坡，Waters公司）；API4000三重四极杆质谱仪（新加坡，Sciex公司），配有电喷雾离子源；天平（CP225D，德国，赛多利斯）；超纯水仪；离心机；振荡器；移液枪；聚丙烯96孔板，2.2mL/孔。

L-精氨酸（L-Arg）标准品，纯度大于99.5%；L-鸟氨酸（L-Orn）标准品，纯度大于99.0%；L-瓜氨酸（L-Cit）标准品，纯度大于98%；尿素（Urea）标准品，纯度大于98.5%；内标，L-精氨酸-13C6盐酸盐（L-Arg-13C6）标准品，纯度大于99.0%；冷冻人肝细胞（十个供体，混合性别，BioreclamationIVT）；Williams’E培养液（Gibco,Invitrogen）；甲醇、乙腈、甲酸、醋酸铵，均为色谱纯；实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

将L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和尿素用甲醇溶解并配制成10mmol/L标准储备液。用50%甲醇水溶液将L-精氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸分别配制成中间浓度工作液，浓度分别为10、20、50、100、200、500、1 000、2 000μmol/L；尿素用50%甲醇水溶液配制成40、80、160、320、640、1 280、2560、4 000μmol/L中间浓度工作液，然后将这4种标准品配制到水中成混合标准溶液，L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸的最终标准溶液浓度 为 0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、50、100μmol/L，尿素的标准溶液浓度为2、4、8、16、32、64、128、200μmol/L。

取100μL样品加入400μL含有1μmol/L L-精氨酸-13C6内标的0.1mol/L柠檬酸甲醇水溶液（v∶v=80∶20），将样品板充分混合均匀后，在4℃条件下4000r/min转速离心20min，取上清液100μL置于新的96孔板中，加入300μL乙腈，充分摇匀后，用于分析。

1.3 色谱条件和质谱条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱子（2.1mm×100mm，1.7μm)；柱温：40℃；进样量：4μL；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液；流速0.6mL/min，梯度洗脱程序为：0～1.0min，保持95% B相；1.0～3.5min，B相由90%线性递减至60%；3.5～4.0min，保持60% B相，4.0～4.5min，B相由60%递增至95%，4.5～5.5min，保持95% B相。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源正离子模式；电喷雾电压为5.5kV；气帘气为20kPa；雾化气为50kPa；辅助加热气为60kPa；离子源温度为600℃；碰撞气为10V；入口电压为10V；碰撞室出口电压为15V；扫描模式为多反应监测MRM。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

本文结合自身实验室条件，比较了几种不同组成成分的流动相：（1）A相 0.3%甲酸水溶液，B相0.3%甲酸乙腈溶液；（2）A相0.1%甲酸水溶液，B相0.1%甲酸乙腈溶液；（3）A相 0.3%甲酸和10mmol/L醋酸铵水溶液，B相0.3%甲酸和10mmol/L醋酸铵水/乙腈（v∶v,5∶95）溶液；（4）A相10mmol/L醋酸铵水溶液，B相纯乙腈。

结果表明，在（3）条件下，尿素无法获得很好的峰形，3种氨基酸的峰形略有拖尾；在（4）条件下，3种氨基酸拖尾较为严重，尿素的基线响应较高，都不太适合用于分析。条件（1）和（2）中，4种物质均能获得较好的峰形和响应信号，且差异不大，考虑到条件（2）更节约试剂，也方便配制，故最终选择条件（2）作为液相条件。

2.2 样品沉淀剂的选择

本实验测定的是肝细胞鸟氨酸循环中4种组分的含量，如何彻底终止该循环，准确测定细胞中这4种组分的含量成为其又一难点。本实验采用蛋白沉淀提取法，分别考察了纯乙腈、纯甲醇、含10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）的甲醇溶液、含1%甲酸的甲醇溶液和含有0.1mol/L柠檬酸的甲醇水溶液（v∶v=80∶20）等不同溶剂的沉淀效果。

结果发现，只有用0.1mol/L柠檬酸甲醇水溶液作为沉淀剂时，能测到肝细胞中4种组分的含量，且加标质控样品均符合要求。而使用其他4种沉淀剂，都无法测到样品中L-精氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸的含量，推测使用这些沉淀剂不能很好的提取到细胞内的这几种物质或是无法使细胞内的鸟氨酸循环彻底终止。

2.3 方法的线性范围、准确度和精密度

该方法中，L-精氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸的线性范围为0.50～100μmol/L，尿素的线性范围为2.00～200μmol/L。标曲采用线性回归，L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和尿素的校正曲线决定系数（R2）分别为0.994 76、0.995 15、0.995 74、0.992 94。校正曲线图如图1～4所示。

图1 L-精氨酸校正曲线

图2 L-鸟氨酸校正曲线

图3 L-瓜氨酸校正曲线

图4 尿素校正曲线

该分析方法中L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸的定量下限分别达到0.5μmol/L、0.5μmol/L、0.5μmol/L和2μmol/L，具有足够的响应和良好的信噪比。尿素的本底基线虽然较高，但其定量下限的信噪比也可达到5以上，满足分析要求。四种物质的定量下限色谱图如图5～8所示。

图5 L-精氨酸定量下限色谱图

图6 L-鸟氨酸定量下限色谱图

图7 L-瓜氨酸定量下限色谱图

图8 尿素定量下限色谱图

本方法用水作为替代基质来定量分析人肝细胞中化合物，故分别做了两组质控样品考察其准确度和精密度，见表1和表2。第一组质控样品为设置低中高3个标准品浓度（L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸的浓度为1.5、20、80μmol/L，尿素的浓度为6、40、160μmol/L）配制在水中，每个浓度6个平行，通过与理论值的偏差来计算其准确度，通过6个平行样品的变异系数来评估精密度。第二组质控样品为在复苏后的人肝细胞（细胞浓度为1×106cells/mL）中加入低中高3个浓度的标准品（浓度同第一组），每个浓度6个平行样品，用于评估其准确度和精密度。

表1 第一组质控样品的准确度和精密度结果

表2 第二组质控样品的准确度和精密度结果

结果表明在两组质控样品中，所有样品的准确度在85.27%～113.94%，相对标准偏差在2.17%～4.28%，均在允许范围内，符合分析要求，证明该方法可成功应用于人肝细胞中的含量检测。

3 结论

本分析方法简便，稳定、可重现，符合方法学的各项验证。该方法首次测定了人体肝细胞中的L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和尿素的含量，为人体内尿素循环的相关后续科学研究提供了坚实的基础。

[1]JMartens-Lobenhoffer,SMBode-Boger.Mass spectrometric quantification of L-arginine and its pathway related substances in biofluids:the road to maturity[J].Journal of Chromatography B,2014,964:89.

[2]Iole Maria Di Gangi,Lino Chiandetti,Antonina Gucciardi,et al.Simultaneous quantitative determination of NG,NG-dimethyl-l-arginine or asymmetric dimethylarginine and related pathway's metabolites in biological fluids by ultrahigh-performance liquid chromatography/electrospray ionization-tandem mass spectrometry [J].Analytica Chimica Acta,2011,677(2):140-148.

[3]CMBrown,JOBecker,PMWise,et al.Simultaneous determination of 6 L-arginine metabolites in human and mouse plasma by using hydrophilic-interaction chromatogramphy and electrospray tandem mass spectrometry[J].Clinical Chemistry,2011,57(5):701.

Determination of L-Arginine,L-Ornithine,L-Citrulline and Urea in Human Liver Cells by Ultra Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry

Chen Cheng1,2，Wang Hong-mei1,Li Xiao-tong1,Tao Yi1,Zhang Xu-min2
(1.Non-GLP BAS,WuXi Apptec,Shanghai 200131;2.School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200433)

In order to determine the content of L- arginine,L- ornithine,L- citrulline and urea in ornithine cycle of human liver cells,an UPLC-MS/MS method was developed for the determination of ornithine arginine in human liver cells.This method uses ACQUITY UPLC BEH Amide column with 0.1% formic acid aqueous solution and 0.1%formic acid acetonitrile as mobile phase chromatography direct tandem mass spectrometry with electrospray ion source and positive ion multiple reaction monitoring mode detection.As human liver cells contain a large number of tested substances,this method uses water as an alternative substrate for detection.The method is proved to be effective and reliable,and conforms to the validation results of the methodology.

L- Arginine;L- Ornithine;L- Citrulline;Urea;Ornithine cycle;Hepatocytes

O657.63 文献标志码：A

2096-0387（2017）06-0055-04

陈澄（1985—），女，上海人，本科，研究方向：新药研发。