黄皮叶中总黄酮的含量测定

沈静琳

（江西医学高等专科学校，江西 上饶 334000）

黄皮叶中总黄酮的含量测定

沈静琳

（江西医学高等专科学校，江西 上饶 334000）

目的 确定黄皮叶中总黄酮含量的测定方法，为其质量标准的制定提供依据。方法 本试验以芦丁为标样，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH系统比色法测定黄皮叶中总黄酮的含量，在510 nm波长处测定其吸收度，从而得到待测物质的总黄酮含量。结果 使用该检测方法，芦丁在0.008～0.056 mg/ml范围内具有良好的线性关系（R2=0.999 1），平均回收率为95.7%，RSD=1.13%（n=6），精密度试验RSD=0.98%，重复性试验RSD=4.98%（n=6），测得3批黄皮叶中的总黄酮含量分别为7.56%，7.65%，7.38%。结论 该含量测定方法精密度高，结果稳定可靠，可用于黄皮叶的质量控制。

黄皮叶；总黄酮；含量测定

黄皮[Clausena lansium（Lour.）Skeels]属芸香科，黄皮叶为其干燥叶，味苦性辛凉。《本草求原》中记载黄皮叶有“解秽除垢，退黄肿”以及解表散热、顺气化痰的功效，常用于治疗流感、疟疾、支气管炎等。近年来有报道称黄皮叶醇提取物具有保肝、抑菌、抗过敏、抗氧化、抗哮喘及潜在的镇咳祛痰等作用。有实验表明黄皮叶水提液中有酚类和黄酮类物质，从乙醇提取物中也进一步分离鉴定出芦丁[1]。现采用优化的超声波法提取工艺对黄皮叶进行提取，考察以NaN02-A1（N03）3-NaOH为显色剂，在碱性条件下于510 nm波长处测量其总黄酮含量的测定方法，以期为进一步研究黄皮叶中黄酮的药理作用及综合开发利用提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UFY-400型400 g摇摆式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司），JA2003型电子天平（上海恒平科学仪器有限公司），KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），RE-52系列旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），HWS24型热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），GZX-9246 MBE电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），岛津AY12O万分之一托盘电子分析天平（SHIMADZU），UV1102紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）。

1.2 材料

芦丁对照品（UV）：成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-12040302。黄皮叶粗粉：采自中山市金钟水库，洗净阴干，粉碎过筛，密封置避光干燥器中保存。

1.3 试剂

无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司），亚硝酸钠（天津市福晨化学试剂厂），硝酸铝（天津市科密欧化学试剂有限公司），氢氧化钠（粒）（天津市福晨化学试剂厂），无水三氯化铝（天津市福晨化学试剂厂），以上试剂均为分析纯。试验中所用水均为实验室自制纯水和蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 黄皮叶中总黄酮的含量测定方法学考察

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁标准品0.010 0 g，置50 ml容量瓶中，加入60%的乙醇适量，采用超声处理使溶解，放冷，加60%的乙醇至刻度，摇匀，即得（每1 ml中含无水芦丁0.2 mg）。

2.1.2 测定波长的确定 精密量取2 ml芦丁对照品溶液于25 ml容量瓶中，加水6 ml，加5%亚硝酸钠溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min；加入10%硝酸铝溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min；加入氢氧化钠试液10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min。以不加芦丁对照品溶液同上法平行操作的相应溶液为空白对照，进行240～600 nm全波段扫描。结果显示，在510 nm处有最大吸收波长，说明可在510 nm处进行含量测定。

2.1.3 线性的测定 精密量取对照品溶液1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、6 ml、7 ml，分别置 25 ml量瓶中，各加水 6 ml，加 5%亚硝酸钠溶液1 ml，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 ml，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以不加芦丁对照品溶液同上法平行操作的相应溶液为空白对照，在最大吸收波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，再用最小二乘法进行线性回归，以吸光值对浓度进行线性回归分析,求得回归方程，A=10.113C，R2=0.999 1，表明芦丁对照品溶液浓度在0.008～0.056 mg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.4 精密度试验 精密量取芦丁对照品溶液3 ml，置25 ml量瓶中，按照“2.1.3”项下方法，自“各加水6 ml”起依法测定吸光度，连续测6次，按吸光度计算标准偏差（SD）为0.002 42，相对标准偏差（RSD）为0.98%。

2.1.5 供试品溶液的制备 精密称取黄皮叶粗粉1.000 g用液液萃取法脱脂后，残渣加60%的乙醇溶解，转移至25 ml量瓶中，用60%的乙醇定容至刻度，摇匀，得供试品溶液。

2.1.6 稳定性试验 精密量取供试品溶液2.5 ml，置25 ml量瓶中，按照“2.1.3”项下方法，自“各加水6 ml”起依法测定吸光度，分别测定显色后放置 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min供试品溶液的吸光度，按吸光度算得其在1 h内标准偏差（SD）为0.009 61，相对标准偏差（RSD）为 2.95%。

2.1.7 重复性试验 精密称取1.000 g同一袋样品6份，按照“2.1.5”项下方法平行操作制备6份供试品溶液，分别精密吸取6份供试品溶液各3 ml，置25 ml量瓶中，按照“2.1.3”项下方法，自“各加水6 ml”起依法测定吸光度，按吸光度计算标准偏差（SD）为0.016 80，相对标准偏差（RSD）为4.98%。

2.1.8 加样回收率试验 精密量取已知浓度的供试品溶液2.5 ml共6份，分别置25 ml量瓶中，再分别加入3 ml的0.2 mg/ml芦丁对照品溶液，按照“2.1.3”项下方法，自“各加水6 ml”起依法测定吸光度。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率，再计算平均回收率与相对标准偏差（RSD）。计算公式：

式中：A为供试品所含被测成分量（mg），B为加入对照品量（mg），C为实测值（mg）。算得平均回收率为 95.7%，RSD为1.13%。表明该含量测定方法的误差以及操作过程的损失较小，可靠性较高。结果见表1。

表1 黄皮叶总黄酮加样回收率试验测定结果

以上数据表明，采用NaN02-A1（N03）3-NaOH系统比色法测定黄皮叶中总黄酮的含量，精密度高，结果稳定可靠。

2.2 黄皮叶中总黄酮的含量测定

精密称取1.000 g黄皮叶粗粉3份，液液萃取法脱脂后，残渣加60%的乙醇溶解，转移至25 ml量瓶中，用60%的乙醇定容至刻度，摇匀，得供试品溶液。精密量取3 ml，置25 ml容量瓶中，加水6 ml，加5%亚硝酸钠溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min；加10%硝酸铝溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min；加入氢氧化钠试液10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min。以不加芦丁对照品溶液同上法平行操作的相应溶液为空白对照，在最大吸收波长处测定吸光度，计算供试品中总黄酮的含量（mg/g），再按含量计算均值。计算公式：

式中：C为供试品溶液的总黄酮浓度（mg/ml），V为供试品溶液定容的体积（ml），n为稀释倍数，W为称样量（g）。算得这批自制黄皮叶粗粉中总黄酮的平均含量为7.53 mg/g。结果见表2。

表2 黄皮叶中总黄酮含量测定结果

3 讨论

试验过程中，我们发现水层挥干后用甲醇难以全部溶解，后改用60%的乙醇转移药渣至容量瓶，并结合文献与药典重新制作坐标曲线，再依法进行含量测定方法的方法学考察。由黄皮叶提取液的理化检识结果来看，具有采用此比色法的条件。

方法学考察结果也表明该方法测定结果较为准确可靠，可初步测定黄皮叶中总黄酮含量。但在回收率试验中测得回收率偏低，可能是由于供试品溶液中某些化学成分对检测产生了干扰，可采用双波长分光光度法或差示分光光度法对该检测方法进行改进[2]。用NaN02-A1（N03）3-NaOH系统比色法测定黄皮叶总黄酮含量，操作简便，结果较为准确可靠。本试验对3批自制黄皮叶粗粉中的总黄酮含量进行测定，结果表明其总黄酮含量较高。借鉴已往对黄皮叶黄酮浓度与其抗氧化性间关系的研究思路，以该批自制黄皮叶粗粉为原料，进一步研究黄皮叶中黄酮类化合物的药理作用[3]，为研究黄皮叶中黄酮的药理作用、开发利用及质量控制提供理论依据。同时，试验表明黄皮叶中黄酮类化合物极性较大，在提取过程中，应尽量避免使用成本较高、毒性较大的有机溶剂，以减少环境污染。黄皮在广东、广西、云南、四川、海南等地广泛种植，资源丰富，在食品药品行业中有较好的应用前景，是一种实用价值很高的植物，值得开发利用与研究。

[1]赵青，李创军，杨敬芝．黄皮叶的化学成分研究[J]．中国中药杂志，2010，35（8）：997-999．

[2]严赞开．紫外分光光度法测定植物黄酮含量的方法[J]．食品研究与开发，2007，28（9）：164-167．

[3]张福平，汤艳姬，刘晓珍，等．黄皮叶黄酮类化合物的抗氧化性研究[J]．南方农业学报，2013，44（8）：1343-1346．

R927．3

A

1671-1246（2018）01-0098-03