DNA修复基因可变剪接及非编码RNA调控网络作为恶性肿瘤发生及预后生物学标志的意义

逯晓波

（中国医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，辽宁 沈阳 110122）

恶性肿瘤是世界范围内严重危害人类健康的疾病之一，在我国其发生率呈逐年上升趋势。恶性肿瘤的发生发展是遗传和环境因素综合作用的结果，找寻有效的遗传生物学标志，做到早期预防和合理治疗，对于提高恶性肿瘤的生存率和生存质量具有重要意义。

环境致癌因子如多环芳烃经体内代谢后成为直接致癌物，攻击DNA等生物大分子，生成DNA加合物等造成DNA的原始损伤，成为癌变的起始动力。目前认为大多数环境致癌因子可损伤DNA并由此导致基因突变和细胞癌变是遗传毒理学研究的核心机制之一。但是正常细胞中也存在着维护自身基因组稳定性的修复系统用来修复环境致癌因子造成的DNA损伤。人体常见的DNA修复系统至少包括碱基切除修复（base excision repair，BER）、核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）、错配修复（mismatch repair，MMR）和双链断裂修复（double strand break repair，DSBR）系统等。它们共同构成对DNA损伤的防卫机制，在细胞DNA受到外界有害刺激损伤后，修复DNA的受损部位，以维持基因组的稳定性。DNA修复效率存在个体差异，不同个体或细胞具有不同DNA修复效率，与恶性肿瘤发生风险及预后治疗密切相关。

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）被称作第三代遗传学标记，其在人类基因组中并不是随机分布的，如果连锁不平衡程度较高，则可能出现SNP在单个区域中的结构模式，即单体型（haplotype）。首类环境应答基因—DNA损伤修复基因的SNP及单体型作为目前复杂疾病重要的生物学标志，一直是肿瘤易感及预后治疗研究的热点［1］。但近年来随着分子生物标志研究的深入，发现基于碱基序列改变的SNP及单体型显然不足以全面反映转录组和蛋白质组多态性，而表观遗传学RNA调控领域的研究进展却拓宽了相应的研究思路。DNA修复基因可变剪接（alternative splicing，AS）及非编码RNA调控网络作为恶性肿瘤发生及预后生物学标志的研究及其意义备受关注。

1 可变剪接（A S）

AS是基因转录后一项精密而复杂的调控机制，属于广义的表观遗传学范畴，是当前遗传学研究的热点之一［2］。真核生物中，绝大多数基因的初始转录产物pre-mRNA必须经过剪接等加工过程，才能形成成熟的mRNA。AS是指同一种premRNA具有多种剪接程序，形成不同的mRNA。在人体中，几乎所有的多外显子初级转录产物都经过AS，平均来说，一个人类基因由8～10个外显子组成，选择性剪接的多样化能力可以使一个单基因产生两个到几千个的剪接异构体。AS的类型主要有7种，分别为内含子保留、可变3′剪接位点、可变5′剪接位点、外显子跳过、互斥可变外显子、可变初始外显子和可变终末外显子等［3］。

AS是蛋白质组多样性和基因表达复杂性的重要机制，也被认为是癌症表达的天然来源［4］，AS的异常改变使得基因在转录后产生剪接异构体，编码出异常蛋白质。剪接异构体和癌症相关的细胞迁移、细胞生长调控、激素响应性、细胞死亡和化疗反应中基因表达变化有关，成为肿瘤的生物标志和分子靶点。有证据表明影响癌基因、抑癌基因和其它癌症相关基因的剪接突变在癌症的起始和发生发展过程中均会出现，并且存在因果联系。但目前导致肿瘤发生过程中剪接缺陷的机制尚不清楚。有研究发现顺式作用元件中的遗传和体细胞突变，反式调节因子的成分、浓度、定位以及活性的变异，都会影响剪接位点的识别和作用，从而导致癌变［5］。

2 D NA修复基因可变剪接与肿瘤

在肿瘤患者体内有许多错配修复基因损伤造成的突变，导致异常mRNA剪接。DNA错配修复基因 MLH1、MSH2、MSH6和 PMS2突变是造成Lynch综合征（又称遗传性非息肉性结直肠癌，HNPCC）和包括Muir-Torre综合征和结构性错配修复缺陷综合征等其他相关遗传性恶性肿瘤的原因。MLH1基因可变剪接最常见的模式是外显子跳过。外显子4、6、9、10、11、15、16和17是最容易跳过的外显子［6］，随着关于MLH1可变剪接的报道越来越多，有研究表明MLH1可变剪接产物代表了这些跳过外显子的不同组合。与MLH1基因相反，MSH2和MSH6可变剪接的机制则是利用隐藏的剪接位点［7］。

NER是DNA损伤修复系统中最重要而灵活的一种，对多种DNA双螺旋损伤变性，如多环芳烃、紫外线C等环境致癌因子介导的DNA加合物，NER发挥主要的切除修复作用。切除修复交叉互补基因1（ERCC1）位于19q13，在启动NER的损伤修复中至关重要，其编码的核蛋白具有结构特异性核酸内切酶活性，在双链DNA交界边缘酶促5′裂解，以切除损伤的寡核苷酸，是NER的限速酶。针对ERCC1可变剪接研究主要集中在卵巢癌细胞对顺铂的敏感性方面，Bosma等［8］应用cDNA文库构建包含人类ERCC1基因的顺铂耐药细胞株，其中9种发现了ERCC1剪接异构体（5′-truncated ERCC1）的存在：即缺少位于第1外显子42 bp的ERCC1剪接异构体。而该42 bp序列可与转录因子抑制剂结合，会减低NER系统功能，但Winter等［9］随后却否定了上述结论，认为该ERCC1剪接异构体可在各种癌组织中广泛表达，与肿瘤发生及预后并无关联。Sun等［10］检测到ERCC1第8外显子缺失的剪接异构体，提出该异构体虽然没有改变ERCC1蛋白表达水平，但能降低NER系统的切除修复能力，增加细胞对顺铂的敏感性。

着色性干皮病互补因子C（XPC）基因编码的XPC蛋白在NER的早期阶段，尤其是在识别损伤、开放复杂结构、修复蛋白质复合物结构起着重要作用。XPC基因跨越33 kb和16个外显子和15个内含子。应用实时定量PCR测量XPC mRNA全长及其剪接异构体，发现在5号外显子上有内含子丢失；另外还有跳过外显子4、7或12的剪接异构体。0.07%XPC基因跳过外显子7，包含大量信息的外显子7具有剪接受体和供体位点位。相比之下，0.7%XPC基因跳过外显子4，包含少量信息的外显子4也具有剪接受体。一个常见XPC基因内含子11剪接受体位点SNP（C/A）降低信息含量。这种异常剪接的XPC mRNA亚型减少了DNA修复功能，更有助于肿瘤的发生［11］。

3 非编码RNA调控网络

近年来，随着二代测序和转录组测序技术的完善，大量新的非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）如微小RNA（microRNA，miRNA）、长链非编码 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）、环状RNA（circle RNA，circRNA）和piRNA（Piwi蛋白相作用的RNA）等相继被报道，不同ncRNA之间也存在相互调节的关系，从而形成一个相对完整的调控网络。

miRNA是一类长度约有18～25个核苷酸的单链小分子RNA，对生命活动具有广泛的调控作用。在动植物体内可以和靶基因mRNA的3′UTR区结合，导致mRNA裂解或抑制翻译来调控相应基因表达。miRNA异常表达可能导致许多人类常见复杂疾病的发生。迄今为止，miRNA与癌症的发生、发展、预后均密切相关。miRNA及其绑定位点的SNP可以影响miRNA介导的调控。近年来随着对于mRNA的3′UTR及miRNA功能研究的不断深入，对于SNP研究的重点已由编码区转向非编码区。Smits等［12］在2011年的研究中发现，KRAS基因mRNA 3′UTR的SNPs rs61764370在结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的早期诊断和治疗策略选择上具有重要意义，发现rs61764370 T等位基因会增加CRC的发生风险。Ahangari等［13］研究发现调控炎症反应的NOD2基因3′UTR区的SNP与CRC发生风险有关，炎症反应会造成DNA损伤、细胞增殖紊乱和异常血管的生成，与肿瘤发生发展相关。

lncRNA是一类核苷酸序列长度大于200 nt的线性RNA，不具备编码蛋白的能力，大量存在于人类基因组中，并且具有组织和细胞特异性，但在不同物种中保守性较差［14］。正是由于lncRNA长度较长，保守性较差，因此lncRNA的结构和功能都较为复杂，但主要是以调控基因表达为主［15］。近年来研究表明lncRNA在正常生命活动和以肿瘤为代表的疾病发生发展中起到了重要作用［16］。在肿瘤研究中，人们发现了许多lncRNA参与到肿瘤的表观遗传调控、细胞周期调控、信号转导、激素调控和DNA损伤修复［17］等。并且，已经发现有些lncRNA既可以与mRNA竞争性结合miRNA，也可以结合到mRNA 3′UTR区，阻止miRNA与mRNA结合［18］。

circRNA是一类最新发现的环状单链非编码RNA，在真核生物和人的所有组织中均有表达，且稳定性较好。相对于miRNA和lncRNA而言，circRNA研究的时间较晚，对其来源了解很有限。目前，人们发现circRNA的主要作用是充当miRNA海绵或RNA结合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）海绵，进而调控基因表达［19-20］。circRNA的产生方式与一般线型RNA不同，主要包括外显子的环化和内含子的环化。circRNA在转录水平以及转录后水平对基因表达调控有着重要的作用，可增强基因的转录。此外，circRNA可调节pre-mRNA的剪接，发现环状外显子环化过程可竞争性抑制pre-mRNA经典剪接过程，从而影响蛋白质的生成［21］。

miRNA可调节lncRNA的表达，进而影响lncRNA的调控作用。Yoon等［22］研究发现miRNA let-7家族可结合Ago2蛋白，从而影响lncRNA-p21的活性。lncRNA也可调控miRNA的表达，如lncRNA序列中存在与miRNA靶目标mRNA相似片段，可结合miRNA，降低miRNA对目标mRNA的调节作用。lncRNA可与mRNA互补配对，导致miRNA-RISC不可与mRNA结合，从而影响其所介导的RNA降解过程［23］。lncRNA也可剪切形成miRNA：lncRNA-MD1能产生miR-206以及miR-133b。LncRNA H19也可剪切生成miR-675［24］。

近期研究表明，circRNA可与某些miRNA结合成为其miRNA的分子海绵，从而抑制miRNA的相关活动。Xie等［25］通过对细胞增殖以及CRC的侵袭过程的研究发现，在CRC组织中，HSA circ_001569可作为miR-145的分子海绵上调miR-145的目标功能基因表达。小脑变性相关蛋白1（CDR1）基因可以翻译生成一种环形反义转录物，称为小脑变性相关蛋白1反义转录物（CDR1as）。CDR1as可以与miRNA相互作用，也可被miR-671切割。随后的研究发现，CDR1as中包含miR-7的70余种结合位点。Li等［26］研究发现cir-ITCH跨越E3泛素蛋白连接酶（ITCH）的某些外显子，对miR-7、miR-17和miR-214也具有海绵作用。

4 非编码RNA对D NA损伤修复的调控

miRNA可以调控DNA损伤的识别、信号转导及损伤修复过程等。共济失调毛细血管扩张症突变基因（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）是直接感受DNA双链断裂损伤并起始诸多DNA损伤信号反应通路的主开关分子，现也被证实ATM基因可能成为许多miRNA调控的靶点，如可受到miR-223、miR-181a、miR-26a、miR-27a、miR-214、miR-18a等的调控，这些miRNA通过对ATM介导的信号转导通路调节增加了细胞对紫外线的敏感性［27］。γH2AX是DNA损伤修复的识别元件，可发现和识别受损的DNA。据研究发现，miR-24以及miR-138可直接作用于γH2AX从而调控DNA损伤修复过程。γH2AX是miR-138的目标基因，miR-138的过度表达会影响组蛋白H2AX的表达，使其表达下调，从而增加受损后染色体的不稳定性，有利于DNA损伤修复。miRNA也可以控制DNA双链断裂修复的非末端连接修复（NHEJ）和同源重组修复（HR）通路。近期研究表明，miR-124可直接结合Ku70、NHEJ通路的关键修复蛋白，从而调控DNA双链断裂修复［28］。miR-9也可结合HR通路的关键修复蛋白BRCA1，阻碍顺铂介导的DNA损伤修复，从而调控卵巢癌的发生［29］。De Summa等［30］通过对家族性和散发乳腺癌病例研究发现miR-17不仅仅对BRCA1基因表达存在有调控作用，其也可作为APE1/REF1的调节因子，进而影响碱基错配修复的进程。miR-17可与BRCA1的3′UTR区相结合进而实现相关调节作用。

Wang等［31］通过对神经胶质瘤的研究发现miR-106a可上调ERCC1基因的表达，从而影响核苷酸切除修复过程。在神经胶质瘤中ERCC1基因的表达程度普遍增加，研究表明ERCC1在U87/DDP和U251/G细胞系中的表达明显高于对照细胞系U87和U251。研究发现在U87/DDP和U251/G细胞系中通过miR-106a可抑制ERCC1表达程度，使其低于对照组的水平，从而证实miR-106a可改变细胞的DNA修复能力。Valeri等［32］将miR-21顺时转入结肠癌细胞后，实验结果得知hMSH2、hMSH6蛋白的表达量在转染后明显下降，证明miR-21可以结合在hMSH2、hMSH6基因mRNA的3′UTR区，通过下调MMR系统的关键基因hMSH2、hMSH6的表达，影响MMR系统功能，从而导致结肠癌的发生。Zhong等［33］研究发现miR-31-5p可以结合在MLH1的mRNA的3′UTR区，抑制miR-31-5p表达后可增加MLH1蛋白的水平，从而调控细胞周期。该试验证明了miR-31-5p通过调控MMR的相关蛋白表达对结肠癌的发展产生影响。

lncRNA可作为DNA损伤后的信号传导分子，刺激细胞对DNA损伤的应答［34］。LncRNA p21就是其中之一，其可结合hnRNP-K共同激活p53依赖的p21基因表达。lncRNA也可诱导细胞在DNA受损后进行修复的过程。lncRNA PANDA已证实具有诱导活性，可调控DNA损伤后的细胞应答［35］。DNA损伤后，PANDA在p53依赖通路中被激活，可与转录元件NF-YA相结合而调控基因表达。lncRNA也可作为指导分子参与DNA损伤修复过程。CCND lncRNAs可复原和调控TLS的活性，从而间接调控DNA损伤修复过程［36］。

此外，在寻找DNA修复基因ERCC1区域上下游10 kb的相关lncRNA以及ERCC1产生的circRNA的一些尝试可供借鉴。在lncRNA相关数据 库（LNCipedia，lncRNAdb，NONCODE v4.0 和Biogazelle）中，预测到若干可能的lncRNAs，根据它们的长度、编码蛋白的能力进行了筛选，得到了两个lncRNA，分别为NONHSAT066776和NONHSA T066779。其中NONHSAT066776位于ERCC1最后一个外显子与内含子交界处，而NONHSAT066779位于ERCC1第二个外显子，并跨该外显子。推测NONHSAT066779则可能通过直接调控ERCC1而影响DNA修复。在circRNA相关数据库（find_circ、MapSplice、CIRCexplorer、circRNAFinder 和deepBase）中，预测出ERCC1多个相关的circRNAs。根据其在不同细胞系中表达的差异，最终得到了两个circRNA，其中hsa-circRNA12243-9由ERCC1转录本 NM_001983.3的第 7、8、9 外显子环化而成；hsa-circRNA12243-14由ERCC1转录本NM_001983.3的第8和第9外显子环化而成。我们推测两个circRNA可能会影响miRNA对ERCC1的调控或者直接调控ERCC1进而影响DNA修复。

综上所述，通过对环境应答基因：DNA修复基因的AS及非编码RNA调控网络的深入研究，寻找有效的肿瘤发生及预后生物学标志，将为实现肿瘤个体化预防及治疗提供重要的理论依据。

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