大鼠慢传输型便秘发病的Cajal间质细胞特异性蛋白c-kit-SCF调控机制研究

刘志昊, 李曙光, 虞向阳, 陈建立, 曹文斌, 赵永魁, 张国志

(1. 河北省唐山市开滦总医院范各庄医院 普通外科, 河北 唐山, 063108; 2. 华北理工大学附属医院 普通外科, 河北 唐山, 063108)

大鼠慢传输型便秘发病的Cajal间质细胞特异性蛋白c-kit-SCF调控机制研究

刘志昊1, 李曙光2, 虞向阳2, 陈建立2, 曹文斌2, 赵永魁2, 张国志2

(1. 河北省唐山市开滦总医院范各庄医院 普通外科, 河北 唐山, 063108; 2. 华北理工大学附属医院 普通外科, 河北 唐山, 063108)

目的分析大鼠慢传输型便秘发病的Cajal间质细胞特异性蛋白c-kit的调控机制。方法成年雄性SD大鼠皮下注射吗啡25 mg/kg, 共45 d, 诱导大鼠慢传输型便秘发病模型。分析便秘大鼠日均粪便粒数和质量及首粒黑便排出时间, Real-time PCR及Western blot法检测便秘大鼠SCF及c-kit蛋白表达水平，酶联免疫吸附测定法分析便秘大鼠体内炎症因子水平变化。结果便秘组大鼠日均粪便粒数明显降低，便粒质量明显升高，首粒黑便排出时间明显延长，且与对照组相比存在显著差异(P<0.05); 便秘组大鼠SCF及c-kitmRNA及蛋白表达水平明显降低，炎症因子IL-1β、IL-2及IL-10水平明显升高，且与对照组相比存在显著差异(P<0.05)。结论SCF及c-kit蛋白调控了大鼠慢传输型便秘发病过程，且此过程与炎症反应有关。

慢性传输型便秘; 荧光定量PCR; 炎症反应; 干细胞因子配体

便秘的发病原因有多方面，如生活方式的改变、遗传因素、精神心理因素、器官动力因素等[1]。Cajal间质细胞是肠道内的慢波起搏细胞，参与调控了肠神经信号的传递过程[2]。c-kit蛋白及其配体干细胞因子(SCF)结合后激活的细胞内信号转导通路是Cajal表型发生变化的重要原因[3]。本研究分析大鼠慢传输型便秘发病的Cajal间质细胞特异性蛋白c-kit的调控机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

清洁级SD大鼠购自中国科学院上海生命科学研究院，许可证号为SYXK(沪)2013-0060。所有大鼠体质量220～240 g, 适应性饲养1周。自由饮食，维持饲养环境温度20 ℃～22 ℃, 湿度55%～65%, 光照12 h/d。复方苯乙哌啶购自常州康普药业有限公司; 引物由上海生工合成; c-kit及SCF检测试剂盒购自Abcam公司; β-actin蛋白检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司; IL-1β、IL-2及IL-10蛋白检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所; 7500荧光定量PCR购自ABI公司; 荧光定量PCR检测试剂盒购自Omega公司。其余试剂为市售分析纯。

1.2 分组及模型复制

24只SD大鼠随机分为对照组和慢传输型便秘发病组。慢传输型便秘组大鼠每日皮下注射吗啡25 mg/kg, 共45 d, 诱导大鼠慢传输型便秘发病。对照组大鼠给予等量的生理盐水皮下注射，共45 d。

1.3 Real-time PCR检测相关蛋白表达

采用SYBR GreenI法按照Omega试剂盒说明书进行。反应体系为20 μL, 扩增程序为: 95 ℃、30 s, 93 ℃、5 s, 60 ℃、20 s, 共36个循环。SCF引物: 5′-CATGCTTTAAGGCCTTTGTCACGAG-3′, 5′-GGAGATGGCAGTTGTGCAGCTA-3′; c-kti引物: 5′-AGATGACGAGCTGGCTCTGGA-3′, 5′-CTGGCTGCCAAATCTXTGTGAA-3′; β-actin: 5′-GGCACAG TCAAGGC TGAGAATG-3′, 5′-A TGG TGG TGAAGACGCCAGTA-3′。

1.4 Western blot法检测相关蛋白表达

根据待检测蛋白质的大小选择合适浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(40 μg/泳道); 电泳后剥离SDS-PAGE胶进行半干法转膜(PVDF膜, 100 V, 1.5 h); 转膜后用5.0%脱脂牛奶封闭1 h; 一抗(1∶200)孵育2 h; 将PVDF膜转入装有磷酸盐缓冲液的洗膜盒中，加入适量的TBST, 洗涤3次(10 min/次); 二抗(1∶200)孵育2 h; 转入装有磷酸盐缓冲液的洗膜盒中洗涤3次(10 min/次); 显影并拍照。以β-actin为内参。

1.5 酶联免疫吸附测定

IL-1β蛋白检测试剂盒购自R&D公司; IL-2蛋白检测试剂盒购自Abcam公司; IL-10蛋白检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。所有的检测操作过程均按照试剂盒说明书进行。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料用平均数±标准差表示，两组比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 便秘大鼠日均粪便粒数和质量及首粒黑便排出时间分析

研究发现，便秘组大鼠日均粪便粒数明显降低，便粒质量明显升高，首粒黑便排出时间明显延长，与对照组相比有显著差异(P<0.05)，见表1。

表1 便秘大鼠日均粪便粒数和质量及首粒黑便排出时间分析

与对照组比较, *P<0.05。

2.2 Real-time PCR分析便秘大鼠SCF及c-kit蛋白表达水平

Real-time PCR检测发现便秘组大鼠SCF及c-kit的水平明显降低，且与对照组相比有显著差异(P<0.05), 见表2。

表2 Real-time PCR分析便秘大鼠SCF及c-kit蛋白表达水平

与对照组比较, *P<0.05。

2.3 Western blot分析便秘大鼠SCF及c-kit蛋白表达水平

Western blot检测发现便秘组大鼠SCF及c-kit的水平明显降低，且与对照组相比存在显著差异(P<0.05), 见表3、图1。

2.4 酶联免疫吸附测定法分析便秘大鼠体内炎症因子水平变化

酶联免疫吸附测定检测发现，便秘组大鼠炎症因子IL-1β、IL-2及IL-10水平明显升高，且与对照组相比存在显著差异(P<0.05), 见表4。

表3 Western blot分析便秘大鼠SCF及c-kit蛋白表达水平

与对照组比较, *P<0.05。

图1 Western blot 分析便秘大鼠SCF 及c-kit 蛋白表达水平

表4 酶联免疫吸附测定法分析便秘大鼠体内炎症因子水平变化

与对照组比较, *P<0.05。

3 讨 论

Cajal间质细胞是肠道慢波信号起搏细胞，参与调控了肠神经信号传递过程。Cajal间质细胞的缺失可能会引起胃肠功能的异常。便秘是临床上常见的胃肠功能紊乱性疾病，其发病过程可能与Cajal间质细胞内的相关调控蛋白表达异常有关。本研究分析大鼠慢传输型便秘发病的Cajal间质细胞特异性蛋白c-kit的调控机制时发现，便秘组大鼠日均粪便粒数明显降低，便粒质量明显升高，首粒黑便排出时间明显延长，且与对照组相比存在显著差异; 便秘组大鼠SCF及c-kitmRNA及蛋白表达水平明显降低，炎症因子IL-1β、IL-2及IL-10水平明显升高，且与对照组相比存在显著差异。因此, SCF及c-kit蛋白调控了大鼠慢传输型便秘发病过程，且此过程与炎症反应有关。

c-kit是细胞内典型的III型受体酪氨酸激酶，在细胞的增殖、迁移、凋亡等过程中均有参与。证据[4]显示c-kit蛋白的异常表达与胃肠道功能的紊乱密切相关。在分析针刺对肝硬化大鼠胃肠动力及胃肠Cajal细胞c-kit表达影响的研究[5]中发现，针刺足三针能明显改善肝硬化大鼠的小肠运动功能，增加大鼠胃肠道c-kit的含量从而改善消化道症状。在分析c-kit在蒽醌类泻剂所致肠动力减退发病机制中作用的研究[6]中也证实，蒽醌类泻剂所致肠动力减退可能与结肠组织中c-kit蛋白表达下调有关。张静瑜等[7]也发现SCF/c-kit的过度激活导致的ICC发生变化可能是IBS的内脏敏化发生的最为重要的基础。以往的研究[8]也发现SCF过度激活c-kit导致的ICC异常电活动的重要原因。

本研究发现，便秘组大鼠SCF及c-kitmRNA及蛋白表达水平明显降低，且与对照组相比存在显著差异，提示二者表达异常也与便秘大鼠的发病过程密切相关。炎症反应是细胞内几乎所有病理过程的共同表现，其也与胃肠功能紊乱密切相关[9]。以往的研究[10]也发现胃肠道紊乱也与炎症过程有明显的相关性。在对加味六磨汤治疗结直肠癌术后早期炎症性肠梗阻的临床研究[11]中也发现，加味六磨汤治疗腹腔镜结直肠癌切除术后早期炎症性肠梗阻疗效确切，可显著改善患者便秘情况，提高临床疗效，降低不良反应的发生，提高生存质量。因此, SCF及c-kit蛋白调控了大鼠慢传输型便秘发病过程，且此过程与炎症反应有关。

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[4] 孙浩, 李卫, 孙可心. 胃肠间质瘤c-Kit和PDGFRA基因突变分析[J]. 解放军医药杂志, 2015, 5(12): 36-40.

[5] 姜承勋. 针刺对肝硬化大鼠胃肠动力及胃肠Cajal细胞c-kit表达的影响[D]. 广州中医药大学, 2013.

[6] 霍明东, 丁曙晴, 丁义江, 等. c-kit在蒽醌类泻剂所致肠动力减退发病机制中的作用[J]. 江苏医药, 2013, 6(11): 1250-1253.

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Studyontheregulationmechanismofspecificproteinsc-kitofinterstitialcellsofCajalinthepathogenesisofslowtransitconstipationinrats

LIUZhihao1,LIShuguang2,YUXiangyang2,CHENJianli2,CAOWenbin2,ZHAOYongkui2,ZHANGGuozhi2

(1.DepartmentofGeneralSurgery,Fan′gezhuangHospitalofTangshanKailuanGeneralHospital,Tangshan,Hebei, 063108; 2.DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei, 063108)

ObjectiveThe explore regulation mechanism of specific proteins c-kit of interstitial cells of Cajal in the pathogenesis of slow transit constipation in rats.MethodsSlow transit constipation in rat model was duplicated by injections of morphine (25 mg/kg, 45 d). The number and weight of fecal granule were assayed. Daily average number of fecal particles, quality, and the time for first black discharge were analyzed. At the same time, the c-kit and SCF expression were detected by Real-time PCR and Western blot. The changes of inflammatory factors such as IL-1β, IL-2 and IL-10 were also detected by ELISA.ResultsDaily average number of fecal particles in constipation group was decreased, quality was higher, and the first time for first black discharge was prolonged, which showed significant differences (P<0.05). The expression levels of c-kit and SCF were decreased significantly, and levels of inflammatory factors IL-1β, IL-2 and IL-10 were higher in constipation rats than the controls (P<0.05).ConclusionThe pathogenic progress of slow transit constipation rats are regulated, which is also related with inflammatory reactions.

slow transit constipation rats; fluorescent quantitative PCR; inflammatory reaction; stem cell factor ligands

2017-06-22

河北省卫生厅项目(20150517)

张国志

R 442.2

A

1672-2353(2017)23-043-03

10.7619/jcmp.201723013