氧化白藜芦醇在体外抑制人肝癌细胞株增殖和迁移的实验研究

杨红专 吴炳火 黄杰

(1.成都市第三人民医院检验科，四川 成都 610031；2.四川大学华西基础医学专业2016级本科生，四川 成都 610041)

氧化白藜芦醇在体外抑制人肝癌细胞株增殖和迁移的实验研究

杨红专1吴炳火2黄杰1

(1.成都市第三人民医院检验科，四川 成都 610031；2.四川大学华西基础医学专业2016级本科生，四川 成都 610041)

目的：研究氧化白藜芦醇对体外培养人肝癌细胞QGY-7701、SMMC-7721增殖和迁移能力的影响。方法采用MTT法测定氧化白藜芦醇抑制肝癌细胞QGY-7701、SMMC-7721生长的IC50；采用Transwell法测定经不同浓度氧化白藜芦醇(25 μM、50 μM和100 μM)以及白藜芦醇50 μM与细胞共培养24 h后细胞的迁移率。结果MTT实验结果显示，氧化白藜芦醇抑制QGY-7701和SMMC-7721细胞的IC50值分别为100.37±21.97 μM和74.39±9.30 μM。Transwell实验结果显示，经25 μM、50 μM、100 μM氧化白藜芦醇和白藜芦醇50 μM处理24 h后，各实验组细胞迁移率分别是74.96±2.85%、60.26±9.25%、38.58±8.69%和46.80±8.43%。且与对照组比较有显著性差异(P<0.05)，氧化白藜芦醇浓度越高，细胞迁移率越低。结论氧化白藜芦醇具有抑制体外培养人肝癌细胞QGY-7701、SMMC-7721的细胞增殖作用；可显著抑制肝癌细胞QGY-7701、SMMC-7721在体外培养条件下的迁移能力，其抑制能力呈浓度依赖性。

氧化白藜芦醇；肝癌细胞；增殖；迁移

原发性肝癌(Primary carcinoma of liver，PLC，简称肝癌)是原发于肝细胞或肝内胆管的恶性肿瘤，是全球发病率最高的癌症之一，其新增患者人数已超过62.6万/年，居恶性肿瘤第五位，死亡患者人数接近60万/年，居肿瘤相关死亡第三位。PLC在我国高发，目前，我国发病患者约占全球的55%；在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌，位居第二。肿瘤转移[1](Metastases)是恶性肿瘤最为显著的特点之一，也是肿瘤防治中的难点。据相关统计，只有10%肿瘤患者死于原发性肿瘤，另外90%肿瘤患者死于因肿瘤侵袭所致的病情恶化或复发[2]。肿瘤的转移是指恶性肿瘤细胞脱离其原发部位，在体内通过各种途径的转运，到达与原发部位不连续的组织，继续增殖生长并形成与原发肿瘤同样病理性质的继发肿瘤的全过程，是恶性肿瘤危及生命的最主要生物学特性[3]。临床数据显示，近30%的患者在明确恶性肿瘤诊断之初，就已经发现有远处转移，而另有近30%的患者可能已经存在隐匿的转移病灶[4]。在对肿瘤的治疗上，有学者认为，未来肿瘤治疗研究的关键应该是能够抑制或控制肿瘤转移的治疗方案和手段[5]。

自20世纪50年代起，系统性化疗法就用于治疗肝癌，但其发展与研究多年来始终停滞不前，迄今尚无标准化化疗药物或治疗方案[6]。因此，寻找有效的化疗药物是目前研究肝癌药物化疗的热点。白藜芦醇(Resveatrol,trans-3,5,4′-trihydroxystilbene，Res)是一类天然来源的二苯乙烯类化合物，存在于虎杖、决明、藜芦、葡萄、花生、桑椹等多种常见食物及药用植物中。研究发现白藜芦醇具有广泛的药理活性[7]，包括：心血管保护作用，抗氧化，抗炎，抗肿瘤等。白藜芦醇作为抗炎药已在德国上市，又因其具有显著的癌症预防及治疗作用而备受关注。氧化白藜芦醇(Oxyresveratrol trans-2,4,3′,5′-tetrahydroxystilbene，Oxyres.)[8]是天然来源的白藜芦醇羟基衍生物，作为桑枝，菝葜等许多传统中药或民族药的有效成分，研究显示氧化白藜芦醇具有诸多药理活性，近年来也开始受到关注。氧化白藜芦醇具有强大的抗酪氨酸酶活性，抑制细胞内酪氨酸酶，抑制黑色素的生成；此外，它还具有明显的抗病毒作用[9]，神经元保护作用，抗氧化，体内外抗炎，抗心血管病，保护肝脏等作用。与具有显著抗肿瘤活性的白藜芦醇相比，氧化白藜芦醇在结构上与白藜芦醇非常相似。那么，氧化白藜芦醇是否也具有类似的潜在的抑制肿瘤活性，于是我们对氧化白藜芦醇的抑制体外肝肿瘤细胞活性进行了初步的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞株：人肝癌细胞株SMMC-7721，人肝癌细胞株QGY-7701，为四川大学华西基础医学与法医学院药理教研室保存。主要药品:氧化白藜芦醇(Oxyres)，纯度>98%，由四川大学药学院王峰鹏教授提供；白藜芦醇(Res)，纯度>99%，成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-14102702。主要试剂与耗材：磷酸盐缓冲试剂PBS，北京中杉金桥生物技术公司；DMEM高糖培养基、小牛血清、0.25% EDTA胰蛋白酶、青霉素、链霉素：成都哈利生物公司；二甲基亚砜DMSO、结晶紫、甲醇：天津市科密欧化学试剂公司；MTT试剂：美国Amresco公司；BD Transwell小室：美国Corning公司；96孔板：耐思生物科技有限公司。主要仪器：TGL16M型高速低温离心机，长沙湘智离心仪器有限公司；倒置显微镜，德国Olympus公司；细胞培养箱，日本SANYO公司；SW-CJ-2FD型超净工作台，苏州净化设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖及IC50的测定

生长曲线采用MTT法进行测定。取对数生长期细胞，消化制成2×104个·ml-1细胞悬液，以每孔2×103个细胞接种于96孔板，细胞贴壁后，更换为含药物的完全培养基，同时设定溶剂对照组，每个浓度组设3个复孔。继续培养不同时间后，更换为无血清培养基，避光条件下每孔加入5 mg·ml-1MTT溶液20 μl，37℃细胞培养箱中继续培养4 h。吸弃培养基，每孔加入DMSO150 μl，置酶标仪中避光振荡5 min，570 nm测定吸光度值。吸光度(A)值的大小可反映细胞活力或细胞数量。按下列公式计算药物对细胞增殖的抑制率。抑制率(%)=(1-A药物组/A对照组)×100%。以时间(h)为横坐标，各组吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。根据48 h各组药物抑制率，使用SPSS21.0统计软件计算药物半数抑制浓度IC50值。

1.2.2 Transwell小室法测定细胞迁移能力

待细胞生长至80%融合状态时，倒掉培养基，PBS润洗3次，更换为无血清DMEM高糖培养基，饥饿培养24 h。细胞用胰酶消化后用无血清培养基重悬，细胞计数后，调整细胞悬液密度，SMMC-7721细胞以每孔1.2×105个，QGY-7701以每孔1.5×105个接种于Transwell小室上室，下室中加入650 μl含有20% FCS的DMEM高糖培养基。药物处理组中，将药物用无血清培养基稀释，加入小室上室，对照组加入等体积空白培养基，继续培养24 h。取出小室，吸弃上室培养基，用PBS润湿的棉签轻轻擦去上室中的未迁移的细胞。小室置于24孔板中，每孔加入10%甲醇500 μl，固定下室细胞5 min，转移小室至新孔中，每孔加入0.1%结晶紫500 μl，室温染色30 min。蒸馏水水洗至水无色，倒置于载玻片上，37℃烘干。迁移细胞计数：染色后的Transwell小室放于显微镜下，随机选取五个视野进行观察拍照和细胞计数。结果：迁移至下室的细胞数量表示细胞的迁移能力。按以下公式计算迁移率：迁移率(%)=(药物组下室细胞数目/对照组下室迁移数目)×100%。

1.2.3 统计学分析

2 结果

2.1 氧化白藜芦醇对人肝癌细胞增殖的作用

2.1.1 氧化白藜芦醇对肝癌细胞株生长曲线的作用

以时间(h)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制细胞生长曲线(如图1)。从生长曲线可见，随着氧化白藜芦醇的浓度增加，其细胞的吸光度越低，说明其活细胞数目越少，随着时间的延长，其细胞的吸光度越低，活细胞数目越少。说明氧化白藜芦醇浓度增加抑制细胞生长的作用越强，随着氧化白藜芦醇作用时间越长，其抑制细胞生长的作用越强。

图1 氧化白藜芦醇对肝癌细胞生长曲线的作用(QGY-7701细胞(上)和SMMC-7721细胞(下))

2.1.2 氧化白藜芦醇对QGY-7701和SMMC-7721细胞细胞增殖半数抑制浓度IC50值(48 h)

从表1中可见，氧化白藜芦醇抑制SMMC-7721细胞较QGY-7701更为敏感。

表1 氧化白藜芦醇对QGY-7701和SMMC-7721细胞细胞增殖半数抑制浓度IC50值

2.2 氧化白藜芦醇对人肝癌细胞迁移的作用

图2结果显示，24 h后对照组细胞向下室迁移明显，各药物处理组细胞迁移受到不同程度抑制，且计数后计算细胞迁移率，氧化白藜芦醇组与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。表2显示不同浓度氧化白藜芦醇和白藜芦醇对肝癌细胞株，QGY-7701和SMMC-7721的迁移率与对照组比较有显著性差异(P<0.05)，氧化白藜芦醇和白藜芦醇在50 μM浓度作用基本相当。

图2 Transwell测定不同浓度氧化白藜芦醇对QGY-7701和SMMC-7721细胞迁移(上图QGY-7701细胞，下图SMMC-7721细胞)

表2 不同浓度氧化白藜芦醇对QGY-7701和SMMC-7721细胞迁移率(n=3)

注：与对照组比较*P <0.05，**P <0.01。

3 讨论

文献报道[7]，白藜芦醇对不同肿瘤细胞的迁移能力具有较强的抑制作用，显示出良好的体内外抑制肿瘤转移的作用，而氧化白藜芦醇在体外对肿瘤细胞是否具有迁移抑制作用未知。因此，我们进一步探讨了氧化白藜芦醇对肝癌细胞QGY-7701迁移能力的影响，并与白藜芦醇进行对比。我们前期研究结果显示[11]，氧化白藜芦醇对6种不同类型肿瘤细胞株具有良好的抗增殖活性，包括人白血病细胞K562、人卵巢癌细胞SK-OV-3、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549、人鼻咽癌细胞HNE-1、人结肠癌细胞SW480。氧化白藜芦醇对这6株细胞体外生长的抑制作用，显示出其良好的抑制肿瘤细胞体外增殖活性。此外，我们发现氧化白藜芦醇不仅能抑制小鼠S180肉瘤的生长，它还能抑制小鼠肝癌H22移植实体瘤的肿瘤生长[12]，抑瘤机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。另外我们还发现，氧化白藜芦醇具有体内抑制H22肝癌实验性肺转移的作用，氧化白藜芦醇均能减少小鼠肺部转移结节的数量(数据未发表)。这些数据均提示氧化白藜芦醇可能具有抑制肿瘤细胞生长和转移的作用，对于氧化白藜芦醇进一步体内外抗肿瘤作用研究，将为开发其药用价值奠定一定的实验基础。

1 Valastyan S, Weinberg R. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms[J]. Cell, 2011, 147(2): 275-292.

2 郝希山. 肿瘤学[M]. 人民卫生出版社, 2010, 119-120.

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4 卢大用. 实验肿瘤转移模型及化疗研究[J]. 河南医学研究, 2003, 12(2): 173-178.

6 中国抗癌协会肝癌专业委员会. 原发性肝癌规范化诊治专家共识[J]. 临床肿瘤学杂志, 2009, 14(3): 259-269.

7 袁霜雪,王东旭,伍秋香,等. 白藜芦醇抑制HCT116结肠癌细胞增殖与Wnt/β-catenin的关系研究[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(4): 537-541.

8 虢小翊,周晋,李顺祥,等. 氧化白藜芦醇(苷)的植物资源分布及药用价值的研究进展[J]. 科技导报, 2011, 29(30): 63-67.

9 Chuanasa T, Phromjai J, Lipipun V, et al. Anti-herpes simplex virus (HSV-1) activity of oxyresveratrol derived from Thai medicinal plant: Mechanism of action and therapeutic efficacy on cutaneous HSV-1 infection in mice[J]. Antiviral Res, 2008, 80(1): 62-70.

11 陈夏静,熊尧,任为,等. 氧化白藜芦醇体内外抑制小鼠肉瘤S180的作用初步研究[J]. 四川生理科学杂志, 2015, 37(4): 174-176.

12 黄玥,熊尧,周黎明. 氧化白藜芦醇体内外抑制肝癌细胞增殖的研究[J]. 中药药理与临床, 2015, 31(3): 34-37.

Oxyresveratrolinhibitsproliferationandmigrationofhumanhepatocellularcarcinomacell

Yang Hong-zhuan1, Wu Bing-huo2, Huang Jie1

(1.Clinical Laboratory, Chengdu Third People′s Hospital, Sichuan Chengdu 610031;2.Grade 2016 Undergraduate, West China School of Basic Medical Sciences& Forensic Medicine, Sichuan Universit, Sichuan Chengdu 610041)

Objective： To study the effects of Oxyresveratrol on the proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma cells: QGY-7701 and SMMC-7721.MethodsProliferation and growth rate curves have been investigated using MTT; migration rates of the cells have been measured with Transwell assay.ResultsMTT tests showed that the cells in the experimental group with the different concentrations of Oxyresveratrol have been significantly inhibited compared with control group. Transwell experiments showed that migration rates of cells in different concentrations of Oxyresveratrol have been significantly decreased compared with the control group.ConclusionProliferation and migration rates of human hepatocellular carcinoma cells QGY-7701 and SMMC-7721 can be inhibited by Oxyresveratrol.

Oxyresveratrol；human hepatocellular carcinoma cells；proliferation；migration

杨红专，男，检验师，主要从事实验室检验工作，Email：798638162@qq.com。

2017-11-12)