沙利度胺抑制卵巢癌细胞SKOV-3体外生长的研究

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(1.皖南医学院第二附属医院 妇产科，安徽 芜湖 241000；2.皖南医学院 病理生理学教研室，安徽 芜湖 241002)

·临床医学·

沙利度胺抑制卵巢癌细胞SKOV-3体外生长的研究

张玲1，高红亮2，吴超2，程倩2，虞乐2，李曙2

(1.皖南医学院第二附属医院 妇产科，安徽 芜湖 241000；2.皖南医学院 病理生理学教研室，安徽 芜湖 241002)

目的：探讨沙利度胺对卵巢癌细胞株SKOV-3的增殖抑制以及凋亡的影响，为后续临床治疗及基础研究提供依据。方法采用MTT法测定不同浓度沙利度胺作用于SKOV-3细胞株24 h后的吸光度，测定其对SKOV-3的增殖抑制率，Tunel染色法鉴定细胞凋亡，流式细胞术检测细胞凋亡，Q-PCR法检测caspase3 mRNA表达水平，Western Blot法检测caspase3蛋白表达水平。结果沙利度胺的浓度从31 μg/mL增加至500 μg/mL时，对于SKOV-3的增殖抑制率从6.22%上升至86%；300 μg/mL沙利度胺处理SKOV-3 24 h后，流式细胞术检测其凋亡率上升为52.66%，明显高于空白对照(P<0.01)。Tunel法在荧光显微镜下观察，沙利度胺组可见大片绿色荧光。同时，沙利度胺处理后的SKOV-3的caspase3 mRNA及蛋白表达量与空白对照组相比也明显上升(P<0.01)。结论沙利度胺能够抑制卵巢癌细胞SKOV-3的增殖并且能够诱导其凋亡。

沙利度胺；卵巢癌细胞；凋亡

卵巢癌作为一种恶性的生殖肿瘤，已经成为发达国家妇女肿瘤致死率第五的疾病。在过去的40年，对于卵巢癌的治愈率并没有显著的改善[1]。目前的治疗手段主要以手术及化疗为主[2-3]。沙利度胺是一种消旋体谷氨酸衍生物，具有镇静、止吐作用，起初用于治疗妊娠呕吐，因严重致畸事件在1961年被禁用[4-5]。目前，欧洲药品管理局(European Medicines Agency，EMA)批准其适应证仅限于治疗多发性骨髓瘤，中国SFDA所批准的适应证仅限于控制瘤型麻风反应症。但临床实践中沙利度胺的应用范围已远远超出了FDA、EMA、SFDA所批准的适应证，在如肾癌、恶性黑素瘤、胶质瘤、淋巴瘤、结直肠癌、肝癌、前列腺癌等实体瘤中的治疗中有一定效果[6-7]。同时，近年的研究发现，沙利度胺具有调节免疫及抗血管生成等作用[8]。这使得沙利度胺再次成为研究的热点。本研究希望通过分子生物学手段来观察沙利度胺对于卵巢癌细胞株SKOV-3增殖凋亡的影响。

1 材料和方法

1．1 材料 人卵巢癌细胞SKOV-3购于中科院上海细胞库。沙利度胺购于常州制药厂，为纯品原料药，溶于二甲基亚砜(DMSO)后得终浓度为50mg/mL的溶液。四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒，TUNEL凋亡检测试剂盒购于碧云天生物有限公司。凋亡试剂盒购于美国Sigma公司。caspase3一抗购于CST公司，二抗购于碧云天生物有限公司。caspase3引物购于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SKOV-3细胞株于含有10%小牛血清的RPMI-1640的培养基中贴壁培养，同时加入双抗(1%青霉素和链霉素)，置于37℃、含5%CO2的培养箱中培养。

1.2.2 增殖抑制率检测 采用MTT 法检测不同浓度沙利度胺处理SKOV-3 24 h后的增殖抑制率。将处于对数生长期的SKOV-3细胞消化，种于96孔板中，保持细胞浓度5×103/孔，培养24 h后，换液，加入沙利度胺终浓度分别为500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62 μg/mL、31 μg/mL的无血清培养基，每个浓度设3个副孔，培养24 h，加入MTT( 5g /L) 各20 μL，4 h 后，吸出培养液，再在每孔加入DMSO150 μL，避光轻微振荡5min使结晶充分溶解，在酶标仪570 nm 波长下测吸光度(C)值。细胞增殖抑制率(%)=(对照组C值-实验组C值)/对照组C值×100%。并计算出沙利度胺的IC50。

1.2.3 流式细胞术检测凋亡率 运用Annexin V- FITC /PI 双染检测沙利度胺作用于SKOV-3 24 h的凋亡率，沙利度胺作用SKOV-3，24 h后，PBS洗两遍，收集上清液离心，然后用0.25%不含EDTA的胰酶消化，制备单细胞悬液浓度1×106个细胞 /mL，离心2000 r/min，5min，PBS洗涤两次，收集细胞，用200 μL缓冲液重悬，分别加入5 μL FITC和10 μL PI，4℃避光孵育15min。用PBS将悬液补充至700 μL，上机检测。

1.2.4 Tunel检测细胞凋亡 采用一步法Tunel细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡，取用处于生长对数期的SKOV-3细胞，消化，种于6孔板中，贴壁培养24 h后，加入沙利度胺作用24 h后，按照试剂盒使用说明完成检测。

1.2.5 Q-pcr检测caspase3表达水平 用300 μg/mL沙利度胺作用处理SKOV-3 24 h，后用Trizol提取药物组与正常对照组细胞RNA。将RNA逆转录为cDNA，条件为：25℃ 10 min, 50℃ 30 min, 85℃5 min。以cDNA作为模板完成实时荧光定量PCR。基因的引物采用Primer5.0软件设计。caspase3的上游引物：5′-GCAAACCTCAGGGAAACATT-3′;下游引物：5′-ACCTGGACAACTGGACTTTT-3′。β-actin：的上游引物：5′-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3′;下游引物：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3′。

1.2.6 Western blot检测caspase3蛋白表达水平 沙利度胺处理SKOV-3 24 h后，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA 1640强裂解液来提取细胞总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度，并将蛋白于-80℃冰箱保存。运用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离所提蛋白，并将蛋白转移至PVDF膜上。用5%BSA封闭2 h后，孵以一抗，4℃摇床过夜。次日，TBST清洗3次，每次5 min。二抗孵育2 h。用冷CCD成像系统观察蛋白表达。结果运用Image J软件分析。

2 结果

2.1 沙利度胺处理后增殖抑制率的比较 通过计算得出沙利度胺的IC50约为300 μg/mL 。MTT实验结果显示：通过与空白组比较，沙利度胺处理后的SKOV-3的增殖能力减弱，并呈浓度依赖关系，其中200 μg/mL与500 μg/mL沙利度胺处理组与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。说明沙利度胺能够有效抑制SKOV-3的增殖，见表1。

表1 沙利度胺不同浓度组细胞增殖抑制率的比较

组别OD值(x±s)抑制率/%沙利度胺组 500μg/mL0.1880±0.05544*86 250μg/mL0.7882±0.11743*42.5 125μg/mL1.1616±0.14238*15.2 62μg/mL1.2696±0.118747.42 31μg/mL1.2860±1.178316.22空白对照组1.3714±0.081330.00F68.406P<0.001

*为与空白对照组比较，P<0.05。

2.2 沙利度胺处理后对SKOV-3细胞凋亡的影响 采用一步法Tunel凋亡染色和流式细胞术检测沙利度胺处理后的SKOV-3的凋亡率。在荧光显微镜下观察，沙利度胺处理组在镜下可见大量绿色荧光，说明凋亡率增加(图1A)。结果显现沙利度胺处理24 h后的凋亡率可达到52.66%，高于空白对照组(图1B)，差异具有统计学意义(P<0.01)。

A.空白对照与沙利度胺处理组Tunel法凋亡检测的比较;B、C.流式细胞术检测空白对照与沙利度胺处理组的凋亡率。*P<0.01vscontrol。

图1 沙利度胺处理后对SKOV-3细胞凋亡的影响

2.3 沙利度胺处理后caspase3表达水平的比较 采用Q-PCR法分析沙利度胺处理组与空白对照组之间caspase3 mRNA的表达水平，发现沙利度胺处理组的SKOV-3细胞的caspase3的表达水平要远远高于正常细胞(图2A)。差异具有统计学意义(P<0.01)。沙利度胺处理组与空白对照组的caspase3表达量，通过Western Blot结果显示，沙利度胺处理组的caspase3的表达量明显高于空白对照组(图2B、C)。差异具有统计学意义(P<0.01)。说明沙利度胺能够促进SKOV-3的凋亡。

A.沙利度胺处理组与空白对照组caspase3 mRNA表达水平的比较;B、C.沙利度胺处理组与空白对照组caspase3蛋白表达水平的比较。

*P<0.01vscontrol。

图2 沙利度胺处理后caspase3表达水平的比较

3 讨论

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，发病率位居所有生殖器官恶性肿瘤的第三位。早期卵巢癌无明显典型症状，发现时，基本已属晚期，对妇女的生命健康造成了巨大的威胁[9-10]。沙利度胺最初作为镇静剂治疗妊娠呕吐，因有致畸作用(婴儿海豹肢)而被禁用。肿瘤患者多有免疫机能的异常, 正常情况下肿瘤与宿主的免疫防御之间处于动态平衡。这种平衡遭到破坏，可使肿瘤处于优势地位而得以发生增殖、扩散和转移。研究显示，沙利度胺对淋巴细胞有调节作用，能诱导细胞毒T 细胞的增殖，降低CD4+和CD8+细胞的比例，从而增加IFN-γ和IL-2 的分泌，IFN-γ和IL-2 本身具有直接抗肿瘤的作用。此外，通过增强NK 细胞活性还可以达到间接抗肿瘤的效果。另一方面，临床前和临床的证据显示，沙利度胺能够诱导T 淋巴细胞分泌IL-2 和IFN-γ，它们又会反馈刺激T 细胞增殖，进而增强机体的抗肿瘤免疫作用[11-13]。故我们希望通过了解沙利度胺在处理卵巢癌细胞SKOV-3后对其的增殖与凋亡的影响，从而为沙利度胺更好地用于临床抗肿瘤应用以及基础研究提供依据。在本研究中我们发现，沙利度胺处理SKOV-3 24 h后,细胞的增殖抑制率随沙利度胺浓度的上升而上升，在沙利度胺的浓度达到250 μg/mL时，增殖抑制率即可达到42%，说明沙利度胺对SKOV-3细胞的增殖具有一定的抑制作用。另外通过流式检测，发现经过沙利度胺处理后的SKOV-3的凋亡率与空白对照组比较明显上升。表明沙利度胺能够有效地诱导SKOV-3的凋亡。经典的凋亡途径分为两条，分别为胞外途径以及胞内途径，死亡受体与配体的结合最终导致死亡信号的传递，死亡受体的死亡结构域(death domain,DD)与信号传导分子结合，形成死亡诱导信号复合物，最终导致了caspase3及下游的caspase的活化。同时有大量研究表明，在多种细胞及各种因素的刺激下，caspase3是凋亡的关键执行者。故我们通过Western Blot及Q-PCR检测caspase3在沙利度胺处理组中的表达情况。结果发现经过沙利度胺处理后的SKOV-3，caspase3的表达量明显升高，说明通过沙利度胺的处理，能有效地激活caspase3，引起SKOV-3的凋亡。但是其中具体的分子机制尚不清楚，有待于后续研究证实。通过本实验，希望能够为以后沙利度胺更好地应用于临床提供研究基础。

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InvitroinhibitingtheproliferationofhumanovarycancercelllineSKOV-3usingthalidomide

ZHANGLing,GAOHongliang,WUChao,CHENGQian,YULe,LIShu

Department of Gynecology & Obstetrics, The Second Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241000, China

Objective：To investigate the effects of thalidomide on inhibiting proliferation and promoting apoptosis of human ovarian cancer cell line SKOV-3 for evidence in clinical use and fundamental research of this drug.Methods: MTT assay was performed to detect the absorbance value of different concentration of thalidomide acting on SKOV-3 24 h after administration for measurement of the inhibition rate. TTUNEL apoptosis detecting kit and flow cytometry were used to detect the cell apoptosis, and Q-PCR to detect the level of caspase-3 mRNA expression. Caspase-3 protein level was determined using Western blot.Results: MTT results showed that the inhibition rate rose up to 86% from 6.22% with thalidomide concentration of 500 μg/mL from 31 μg/mL. Apoptosis rate of SKOV-3 was up to 52.66% after thalidomide treatment by final concentration of 300 μg/mL, which was significantly higher compared to the control group(P<0.05). Large areas of the green fluorescence were observed under fluorescent microscope, and the mRNA and protein levels of caspase-3 in SKOV-3 after thalidomide administration were significantly increased as compared with the blank control group(P<0.01).Conclusion: Thalidomide is able to inhibit the proliferation and promote apoptosis of ovarian cancer cell line SKOV-3.

thalidomide; ovarian cancer; cell apoptosis

1002-0217(2017)05-0433-04

安徽省高校优秀青年人才支持计划重点项目(gxyqZD2016172)；大学生创新训练计划(201510368038； 201610368116 )

2017-06-02

张 玲(1978-)，女，主治医师，(电话)13855308893，(电子信箱)71926023@qq.com；李 曙，男，副教授，(电子信箱) yxx2003@126.com，通信作者。

R 737.31

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.05.007