紫外-ARTP复合诱变选育达巴万星前体高产菌株

王小连，郄丽萍，马 婕，代明伟，邓佩佩

(华北制药集团新药研究开发有限责任公司，微生物药物国家工程研究中心，河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北 石家庄 050015)

紫外-ARTP复合诱变选育达巴万星前体高产菌株

王小连，郄丽萍，马 婕，代明伟，邓佩佩*

(华北制药集团新药研究开发有限责任公司，微生物药物国家工程研究中心，河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北 石家庄 050015)

采用紫外-常压室温等离子体(ARTP)技术对达巴万星前体产生菌野野村放线菌属(Nonomuriaspp.)菌株DW-3-19进行复合诱变，并进行链霉素抗性突变选育，获得了具有稳定遗传性的高产菌株，该菌株发酵单位比出发菌株提高了68.7%。表明，ARTP技术可有效应用于放线菌的诱变选育，紫外-ARTP复合诱变可提高达巴万星前体发酵单位，降低生产成本，为短时间内获得稳定遗传的高产菌株提供了可行的方法。

达巴万星前体；紫外诱变；ARTP诱变；致死率；正突变率

达巴万星(dalbavancin)是一种新型半合成糖肽抗生素，由Durata公司开发，于2014年5月23日获FDA批准上市。达巴万星是由5种紧密相关的活性同系物A0、A1、B0、B1 和B2组成的混合物，其中B0是主要组分。这5种化合物均以天然抗生素A-40926为前体合成[1]。A-40926B0由野野村放线菌属(Nonomuriaspp.)发酵产生，与替考拉宁有着相似的构型与活性[2]，对革兰氏阳性菌导致的急性细菌性皮肤感染及软组织感染有很好疗效，对减少耐药性细菌的产生和维持其它抗菌药物的有效性也有显著效果[3-5]。

常压室温等离子体(ARTP)中的有效粒子作用于微生物，能够使其细胞壁或细胞膜的结构和通透性改变，并引起基因突变，进而导致微生物性状和代谢变化。ARTP诱变育种具有操作简单、突变率高、安全性高、易获得遗传稳定性良好的突变株等优点，已成功运用到真菌、细菌等微生物的菌种选育，成为微生物快速突变的有效手段[6-8]。

作者在此采用紫外-ARTP技术对达巴万星前体产生菌野野村放线菌属菌株DW-3-19进行复合诱变，并进行链霉素抗性突变选育，以期获得具有遗传稳定性的高产菌株。

1 实验

1.1 菌株、试剂与仪器

放线菌DW-3-19，自行保藏。

A-40926B0标准品，美国Sigma公司；酵母膏，北京双旋微生物培养基制品厂；玉米浆，华北制药康欣有限公司；工业蛋白胨，英国OXOID公司；工业酵母粉(工业级)。

常压室温等离子体诱变仪，无锡源清天木生物科技有限公司；LA-2010A型高效液相色谱仪，日本岛津公司；紫外诱变箱，自制。

1.2 培养基

斜面及普通分离平板培养基(g·L-1)：蛋白胨5，酵母粉3，琼脂20，消前pH值7，121 ℃灭菌30 min。

种子培养基(g·L-1)：淀粉20，工业蛋白胨12，工业酵母粉20，碳酸钙8，pH值自然，121 ℃灭菌30 min。

发酵培养基(g·L-1)：淀粉32，工业蛋白胨5，玉米浆12，棉籽饼粉5，L-缬氨酸1，碳酸钙2，pH值自然，121 ℃灭菌30 min。

1.3 方法

1.3.1 单孢子悬液的制备

用10 mL无菌生理盐水洗下斜面孢子，在装有十几块玻璃渣的锥形瓶中振荡打散，过滤，制成浓度为107个·mL-1的单孢子悬液。

1.3.2 紫外诱变

取5 mL出发菌株DW-3-19单孢子悬液于9 cm玻璃平皿中，进行紫外诱变后，涂布分离平板培养基，培养一定时间，挑选存活突变株进行摇瓶初筛和复筛，得到突变株DW-4-127。

紫外诱变条件：功率15 W，波长254 nm，诱变距离36 cm，诱变时间0～90 s。

摇瓶培养方法：用接种铲将斜面菌种接种于装有30 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、220 r·min-1摇瓶培养48 h，然后以10%接种量接种到装有40 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、220 r·min-1培养7 d。

1.3.3 ARTP诱变及链霉素抗性突变株选育

取10 μL突变菌株DW-4-127菌悬液均匀涂布在不锈钢载片上，按预定程序进行ARTP诱变；将不锈钢载片投入装有1 mL无菌生理盐水的离心管中，振荡1 min，回收菌体；用生理盐水稀释诱变过的菌悬液，涂布于链霉素抗性培养基平板上，28 ℃培养7～9 d，挑选存活突变株按1.3.2摇瓶培养方法进行初筛和复筛，得到突变菌株DW-5-52。

ARTP诱变条件：高纯氦气，功率120 W，工作气流量10 L·min-1，诱变距离2 mm，诱变时间为0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s。

1.3.4 效价测定

用6 mol·L-1NaOH溶液调节发酵液pH值至10.5左右，摇匀，静置1 h；取3 mL用相同体积乙醇浸提，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，用有机滤膜过滤，采用HPLC法测定A-40926B0组分的含量[9]。

2 结果与讨论

2.1 紫外诱变选育

2.1.1 紫外诱变时间的选择

紫外诱变是实验室最常用而且有效的诱变育种方法，它能引起微生物的DNA结构改变。放线菌DW-3-19紫外诱变0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s后的致死率和正突变率如图1所示。

图1 紫外诱变时间对致死率、正突变率的影响Fig.1 Effect of UV mutagenic time on death rate and positive mutation rate

由图1可以看出，放线菌DW-3-19紫外诱变45 s时的正突变率最高，为14.5%。放线菌DW-3-19对紫外照射较敏感，较高的致死率有利于筛选优良菌株，但如果紫外照射时间过长，一些活性高的菌株也可能致死；考虑到紫外诱变后仍有其它诱变处理，致死率也不宜过高。因此，选择45 s作为紫外诱变时间。

2.1.2 紫外诱变突变株的选育

将紫外诱变后的菌悬液稀释一定倍数后涂布到分离平板培养基上，培养7～9 d后挑取975株形态良好的单菌落，经摇瓶初筛、复筛后得到突变菌株DW-4-127，其发酵单位比出发菌株DW-3-19提高了33.5%。

2.2 ARTP 诱变及链霉素抗性突变株的选育

2.2.1 菌悬液溶剂对ARTP诱变的影响

无菌生理盐水制备的菌悬液在ARTP诱变过程中容易干燥，诱变时间越长干燥越明显，菌体致死率越高。因此，有必要对ARTP诱变过程中的菌悬液溶剂进行筛选。表1为3种菌悬液溶剂对ARTP诱变致死率的影响。

表1 菌悬液溶剂对ARTP诱变致死率的影响

由表1可知，无菌生理盐水菌悬液在ARTP诱变过程中水分挥发加速，导致胞外高盐环境，增大了诱变损伤，ARTP诱变40 s致死率就达到100%；10%甘油菌悬液的致死率随ARTP诱变时间的延长逐渐升高，在诱变40 s内均能保持菌悬液液体状态，有效降低了ARTP诱变对菌体造成的干燥损伤；30%甘油具有脱水作用，导致菌体脱水死亡，ARTP诱变50 s时致死率就达到100%。因此，选择10%甘油制备菌悬液进行ARTP诱变。

2.2.2 ARTP诱变时间的选择

用10%甘油制备DW-4-127菌悬液，ARTP诱变0 s、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s后的致死率和正突变率见表2。

由表2可知，随着ARTP诱变时间的延长，致死率逐渐升高，正突变率则先升高后降低，在30 s时达到最高，此时致死率也在合适的范围。因此，选择30 s作为ARTP诱变时间。

表2 ARTP诱变时间对致死率、正突变率的影响

2.2.3 链霉素最低抑制浓度的确定

制备链霉素浓度为0.2～1.0 mg·L-1的抗性培养基平板，涂布ARTP诱变菌悬液，28 ℃培养7～9 d。结果发现，随着链霉素浓度的增大，抗性培养基平板上生长的菌落逐渐减少，当链霉素浓度增大到0.6 mg·L-1时，抗性培养基平板上已无菌生长，可见链霉素对菌株DW-4-127的最低抑制浓度为0.6 mg·L-1。

2.2.4 链霉素抗性突变株的选育

突变菌株DW-4-127经ARTP诱变后涂布于链霉素浓度为0.6 mg·L-1的抗性培养基平板上，挑选400株进行摇瓶初筛和复筛获得一株高产菌株DW-5-52，其发酵单位比突变菌株DW-4-127提高了23.9%，比出发菌株DW-3-19提高了68.7%。

2.3 高产菌株DW-5-52的遗传稳定性

采用斜面传代的方法，以出发菌株DW-3-19为对照(发酵单位以100计)，考察DW-4-127和DW-5-52的遗传稳定性，结果见图2。

图2 高产菌株的遗传稳定性Fig.2 Genetic stability of high-yield strain

由图2可以看出，紫外诱变得到的突变菌株DW-4-127的遗传稳定性不太好，发酵单位在斜面传代4代后就明显下降，高产特性基本消失；而紫外-ARTP复合诱变得到的高产菌株DW-5-52斜面传代5次的发酵单位仍然很高，遗传稳定性较好。

3 结论

以放线菌DW-3-19为出发菌株，采用紫外-ARTP技术对其进行复合诱变。结果发现，紫外诱变得到的突变菌株DW-4-127的发酵单位比出发菌株提高了33.5%，但传代到第4代出现菌种衰退现象；突变菌株DW-4-127经ARTP诱变复合0.6 mg·L-1链霉素抗性选育获得的高产菌株DW-5-52的发酵单位比突变菌株DW-4-127提高了23.9%，比出发菌株DW-3-19提高了68.7%，且遗传稳定性很好。表明，采用紫外-ARTP复合诱变，再结合链霉素抗性选育可有效避免单一诱变剂产生的诱变饱和效应、大幅降低后期筛选量、大幅提高正突变率，为短时间内获得稳定遗传的高产菌株提供了可行的方法。

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BreedingofDalbavancinPrecursorHigh-YieldStrainbyUV-ARTPCompositeMutagenesis

WANG Xiao-lian,QIE Li-ping,MA Jie,DAI Ming-wei,DENG Pei-pei*

(NewDrugResearch&DevelopmentCompanyofNCPC,NationalEngineeringResearchCenterofMicrobialMedicine,HebeiIndustryMicrobialMetabolicEngineering&TechnologyResearchCenter,Shijiazhuang050015,China)

Dalbavancin precursor-producing strainNonomuriaspp.DW-3-19 was breeded by UV-atmospheric and room temperature plasma(ARTP) composite mutagenesis and streptomycin-resistant mutant screening.The results showed that a high-yield strain possessing stable genetic performance could be obtained using the composite mutagenesis，and the transformation efficiency was increased by 68.7% over the starting strain.The results also show that ARTP mutagenesis can be effectively used for the mutagenic breeding ofActinomycetes.UV-ARTP composite mutagenesis can improve the fermentation unit of dalbavancin precursor,reduce production cost,and obtain the high-yield strain with stable genetic performance in a short time.

dalbavancin precursor;UV mutagenesis;ARTP mutagenesis;death rate;positive mutation rate

河北省科技条件建设项目(中央引导地方科技创新专项)(169676404G)

2017-08-11

王小连(1983-)，女，河北石家庄人，工程师，从事生物制药研究，E-mail:wangtongxi2002@163.com；通讯作者：邓佩佩，工程师，E-mail:401693740@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.12.014

王小连，郄丽萍，马婕，等.紫外-ARTP复合诱变选育达巴万星前体高产菌株[J].化学与生物工程，2017，34(12)：59-62.

TQ465.92 TQ920.1

A

1672-5425(2017)12-0059-04