长链非编码RNA-尿路上皮癌相关分子1在宫颈癌中的表达及临床意义

刘珊珊，张国胜，潘静

（1.潍坊护理职业学院，山东 潍坊 262500；2.山东省潍坊市益都中心医院 妇产科，山东 潍坊 262500）

长链非编码RNA-尿路上皮癌相关分子1在宫颈癌中的表达及临床意义

刘珊珊1，张国胜1，潘静2

（1.潍坊护理职业学院，山东 潍坊 262500；2.山东省潍坊市益都中心医院 妇产科，山东 潍坊 262500）

目的检测长链非编码RNA（lncRNA）-尿路上皮癌相关分子（UCA1）在宫颈癌组织中的表达，探讨UCA1与宫颈癌临床病理特征、术后生存率及预后间的关系。方法利用lncRNA芯片筛选宫颈癌及癌旁组织中差异表达的lncRNAs；利用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测宫颈癌组织及配对癌旁组织中UCA1的表达；利用Spearman秩相关分析UCA1与宫颈癌患者临床病理特征之间的关系；利用生存分析曲线UCA1与宫颈癌患者术后5年生存率的关系；利用Cox风险比例模型分析UCA1与宫颈癌患者预后的关系。结果UCA1在宫颈癌表达水平高于癌旁组织；UCA1的表达与宫颈癌FIGO分期相关（P=0.015）；UCA1高表达的宫颈癌患者术后5年生存率低于低表达的患者，UCA1表达及FIGO分期为宫颈癌患者独立的预后指标。结论UCA1在宫颈癌中表达升高，并与宫颈癌患者生存及预后密切相关。

尿路上皮癌相关分子；宫颈癌；预后；生存

全球每年因宫颈癌而死亡的患者数高达53万， 死亡人数位居妇科肿瘤的第2位[1]。放射治疗、化学治疗和根治性切除术已成为了宫颈癌的标准化治疗方案[2]。然而，宫颈癌患者术后预后差异仍非常显著，且临床上缺乏有效的判断患者预后的分子标志物。因此，更深入的理解宫颈癌发生、发展的分子机制、鉴定有效的治疗靶点及预后判断分子标志物对宫颈癌患者的个体化治疗及提高整体生存率意义重大。

随着基因芯片及基因测序技术的飞速发展，越来越多的非编码RNA已被证实在疾病的诊断及治疗中具有重要的作用。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在过去被认为是基因组RNA中的“转录噪声”，近年来也被证实，可在表观遗传水平、转录及转录后水平调控基因的表达[3]。H19[4]、MALAT1[5]和HOTAIR[6]也被证实在中的发生、发展中扮演着重要的角色。有研究报道，TUG1[7]、MEG3[8]和ANRIL等[9]lncRNAs可促进宫颈癌细胞的增殖及转移。然而，尿路上皮癌相关分子1（urothelial can cer associated 1，UCA1）在宫颈癌中表达及临床相关性尚无研究报道。本研究通过基因芯片筛选出UCA1在宫颈癌组织中表达上调，并证实UCA1的表达与宫颈癌患者生存及预后密切相关。本研究有助于鉴定新的宫颈癌治疗分子靶点及预后判断标志物。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 临床标本选取2007年12月-2010年12月于本研究所用宫颈癌组织及癌旁组织，入组患者在潍坊市益都中心医院妇产科确诊为宫颈癌并行根治性切除术。同一患者肿瘤组织及配对癌旁组织切除后，立刻储存于液氮之中，备后续实验使用。所有入组患者均亲自签署知情同意书，同意其标本用于本项研究。患者入组前均未接受放化疗，且无其他器官重大疾病史。术后生存资料采用电话方式进行回访，回访时间以患者死亡或本研究截止之日。

1.1.2 实验试剂和仪器RNA提取试剂RNAiso reagent、逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒（购自日本TaKaRa公司）。宫颈癌组织及癌旁组织间lncRNA表达谱差异委托上海伯豪公司行lncRNA芯片检测。4℃高速离心机（购自德国Eppendorf公司），置入-80℃冰箱冷冻保存（购自青岛海尔公司）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取研磨组织至粉末状，加入适量的RNAiso reagent，再研磨直至裂解液呈透明状，将匀浆转移至离心管，12 000 r/min，4℃离心5 min。向上清液中加入1/5体积RNAiso reagent的氯仿，震荡至溶液呈乳白状，再次12 000 r/min，4℃离心15 min。离心后溶液分为3层，即无色的上清液、中间白色蛋白层及下层有机层。吸取上清液转移至新的离心管，加入等体积异丙醇，12 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清液，加入500μl 75%的乙醇，再次12000r/min，4℃离心5 min。所得沉淀即为RNA，加入200 μl去离子水，置入-80℃冰箱冷冻储存。

1.2.2 逆转录取总 RNA 2 μl，加入10 mmol/L dNTP，Oligo（dT）（0.5 μg/μl）各 1 μl。70℃ 5 min，冰上放置2 min。加入 10×Buffer 2μl，RNase抑制剂 1 μl，逆转录酶 1 μl。混匀后 42℃ 60 min，80℃5 min。所得产物即为cDNA模板。

1.2.3 qRT-PCR加入 125 μl的 20×SYBR溶液至1.0 ml 2.5×Real Master Mix中，所得溶液作为试剂A。实验采用20 μl体系，内还有9 μl试剂A，1 μl 20×ROX Reference Dye，1μl正向引物，1 μl反向引物，cDNA 模板 2 μl，6 μl去离子水。qRT-PCR 的反应条件 为：95℃ 2 min；95℃ 20 s，60℃ 20s，72℃ 30s，共循环35个。UCA1正向引物：5'-CTCTCCATTGGGTTCACCATTC-3'；反向引物：5'-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3'；U6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACG CTTCACGAAYYYGCGT-3'。计算公式为：UCA1相对表达量：2-ΔΔCt=2-[（CtUCA1-CtU6）待测样本-（CtUCA1-CtU6）校准样本]。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件，采用配对设计的t检验分析宫颈癌组织与癌旁组织间UCA1的表达水平差异，采用Spearman秩相关分析UCA1表达水平与宫颈癌患者临床病理特征之间的关系，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线及Log-rank检验分析UCA1表达水平与宫颈癌患者生存周期间的关系，采用Cox风险比例模型分析UCA1的表达水平与宫颈癌患者预后的关系，检验水准α入=0.050，α出=0.100，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌及癌旁组织中差异表达的lncRNAs

提取5例宫颈癌及同一患者配对癌旁组织标本的RNA，利用LncRNA芯片检测在宫颈癌组织及癌旁组织中差异表达的lncRNAs。经数据分析后检测发现，与癌旁组织比较，在宫颈癌中有21个上调、63个下调的lncRNA。取上调和下调的30个lncRNAs制备热图，结果显示UCA1在宫颈癌组织中表达上调，而在癌旁组织中表达下调（见图1），提示UCA1可能参与宫颈癌发生、发展的调控。

图1 宫颈癌组织及癌旁组织中差异表达的lncRNAs

2.2 UCA1在宫颈癌和癌旁组织中的表达

qRT-PCR结果显示，71例癌旁组织中UCA1的相对表达量为（0.914±0.751），71例宫颈癌组织中UCA1的相对表达量为（6.137±2.984），经t检验，差异有统计学意义（t=5.194，P=0.015），见图 2。宫颈癌组织中UCA1的表达水平高于癌旁组织。

图2 宫颈癌组织及癌旁组织中UCA1的相对表达水平

2.3 UCA1与宫颈癌临床病理特征的关系

根据宫颈癌组织中UCA1表达的均数6.137，将UCA1表达水平高于6.137的患者作为UCA1高表达组，将UCA1表达水平低于6.137的患者作为UCA1低表达组，利用Speraman秩相关分析UCA1表达水平与宫颈癌临床病理特征的关系。结果显示，UCA1的表达水平与宫颈癌FIGO分期密切相关，随着FIGO分期的进展，UCA1的表达逐渐升高（r=0.614，P=0.015），见表1。而UCA1表达水平与宫颈癌的其他临床病理特征，包括年龄、HPV状态、肿瘤类型及组织分化程度均无相关性（见表1）。提示UCA1的表达与宫颈癌的病情进展呈正相关。

表1 UCA1的表达与宫颈癌临床病理特征的关系

2.4 UCA1与宫颈癌术后5年生存率的关系

生存曲线结果显示，UCA1的表达与宫颈癌患者术后5年总体生存率（Log-rank检验：P=0.008，见图3A）及无进展生存率（Log-rank检验：P=0.021，见图3B）密切相关，UCA1高表达组的宫颈癌患者术后5年生存率及无进展生存率低于UCA1低表达组。

2.5 UCA1与宫颈癌预后的关系

Cox风险比例模型多因素分析结果显示，UCA1高表达组宫颈癌患者术后总体生存风险系数为3.791（95%CI：1.984，10.314，P=0.019），UCA1 高表达组宫颈癌患者术后无进展生存风险系数为2.715（95%CI：1.613，5.187，P=0.032）。UCA1 为宫颈癌患者术后总体生存预后及无进展生存预后的独立预测指标。此外，FIGO分期也被证实为宫颈癌患者术后总体生存预后（＾HR=4.185，95%CI：2.145，13.314，P=0.008）及无进展生存预后（＾HR=5.134，95%CI：2.114，7.875，P=0.011）的独立预测指标。而其他病理特征与宫颈癌患者术后预后无关。见表2、3。

图3 UCA1的表达与宫颈癌患者术后生存率的关系

表2 UCA1的表达与宫颈癌术后总体生存预后的关系

表3 UCA1的表达与宫颈癌术后无进展生存预后的关系

3 讨论

LncRNA为近年来的研究热点，一系列研究结果表明lncRNA的表达与肿瘤的发生、发展密切相关。与编码蛋白的mRNA不同，大多数lncRNAs的表达具有极高的组织特异性。YANG等的研究显示，lncRNA PVT1在宫颈癌患者血清中表达异常升高，并与患者的肿瘤体积及临床分期密切相关，且可作为宫颈癌早期诊断的分子标志物[10]。CAO等的研究显示，lncRNA-SPRY4-IT1在宫颈癌组织中的表达水平高于癌旁组织，且可作为判断宫颈癌患者生存及预后的独立分子标志物[11]。lncRNA在宫颈癌的发生、发展中发挥重要的作用，然而，仅仅少数的lncRNAs得到较为充分的研究，大多数lncRNAs在宫颈癌中的表达及功能尚未得到充分研究。

通过lncRNA芯片筛选宫颈癌组织及癌旁组织中差异表达的lncRNAs，本研究发现lncRNA-UCA1在宫颈癌组织中的表达高于癌旁组织，根据宫颈癌中UCA1的表达水平将患者分为UCA1高表达组及低表达组，结果显示UCA1的表达与宫颈癌FIGO分期密切相关，UCA1高表达的宫颈癌患者术后5年生存率高于低表达的患者，UCA1表达及FIGO分期为宫颈癌患者独立的预后判断指标。UCA1在胰腺癌[12]、结肠癌[13]及脑胶质瘤[14]多种肿瘤中已证实发挥重要的作用。NI等的研究显示，UCA1在结肠癌中表达上调，并与结肠癌的淋巴结转移、远处转移及肿瘤分期密切相关，并可作为结肠癌独立的判断预后的分子标志物[15]。FANG等的研究显示，UCA1在口腔鳞状细胞癌中表达上调，此外，在发生淋巴结转移的患者的组织中UCA1的表达要高于原位肿瘤患者[16]。与既往研究结果相符，笔者的研究也证实UCA1在宫颈癌中可能作为癌基因发挥作用，并与肿瘤的分期密切相关。

近年来，有研究认为UCA1可作为调控不同信号通路中关键分子而参与肿瘤的发生及进展。YANG等的研究显示，UCA1可通过PI3K/AKT而调控CRBE的表达，进而调控膀胱癌细胞周期[17]。另有研究报道，UCA1可通过 mTOR-STAT3/miR-143-HK2途径而调控膀胱癌肿瘤细胞的葡萄糖代谢水平[18]。此外，研究显示在膀胱癌中miR-1可调控UCA1的表达[19]，提示microRNA和lncRNA间有着复杂的调控机制。因此，后续研究有必要进一步深入研究UCA1在肿瘤中扮演癌基因的分子机制。

本研究通过lncRNA芯片及qRT-PCR技术筛选并证实长链非编码RNA-UCA1在宫颈癌组织中表达上调，并与宫颈癌患者的FIGO分期密切相关。更为重要的是，研究发现UCA1可作为判断宫颈癌患者生存及预后的分子标志物。本研究结果为鉴定宫颈癌诊断及治疗的分子靶点奠定必要的基础。

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Significance of long non-coding RNA urothelial cancer associated 1 in cervical cancer

Shan-shan Liu1,Guo-sheng Zhang1,Jing Pan2
(1.Weifang Nursing Vocational College,Weifang,Shandong 262500,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,Yidu Central Hospital of Weifang,Weifang,Shandong 262500,China)

ObjectiveTo investigate the expression level of long non-coding RNA (lncRNA)urothelial cancer associated 1 (UCA1)in cervical cancer,and evaluate its prognostic value in cervical cancer.MethodsCancer tissue as well as adjacent normal tissue from patients diagnosed with cervical cancer were harvested in this study.LncRNA arrays were performed to identify differentially expressed lncRNAs.Expression of UCA1 was measured by qRT-PCR.Spearman rank correlation analysis was performed to evaluate the association between UCA1 and clinical manifestation of cervical cancer patients.K-M survival analysis was utilized to determine correlation of UCA1 expression with 5-year survival.Cox's proportional hazards regression models were applied to analyze the relationships between UCA1 and prognosis of cervical cancer patients.ResultsUCA1 was upregulated in cervical cancer tissues compared with normal tissues.Expression of UCA1 was closely associated with FIGO stage of cervical cancer (P=0.015).Expression of UCA1 was negatively correlated with 5-years survival rate.UCA1 and FIGO stage were independent prognostic risk factor of cervical cancer.ConclusionUCA1 is upregulated in cervical cancer,and is negatively associated with outcome of cervical cancer.

UCA1;cervical cancer;prognosis;survival

R737.33

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.30.009

1005-8982（2017）30-0051-05

2017-05-23

（王荣兵 编辑）