棕榈酸对转化生长因子β1刺激的肝星状细胞增殖、凋亡及Caspase-12蛋白表达的影响*

李雅楠 ，闫宇 ，王铭 ，刘芳 ，肖永红

（华北理工大学 1.公共卫生学院，2.临床医学院，河北 唐山 063000）

棕榈酸对转化生长因子β1刺激的肝星状细胞增殖、凋亡及Caspase-12蛋白表达的影响*

李雅楠 1，闫宇 2，王铭 1，刘芳 1，肖永红 1

（华北理工大学 1.公共卫生学院，2.临床医学院，河北 唐山 063000）

目的研究棕榈酸对转化生长因子β1（TGF-β1）刺激的肝星状细胞（HSC）增殖、凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（caspase-12）蛋白表达的影响。方法将液氮保存下的肝星状细胞株，于37℃、5%CO2孵箱中进行复苏传代培养，同步化后将细胞分为5组：空白组、TGF-β1（5 ng/ml）组、TGF-β1+低、中、高剂量棕榈酸组，即5 ng/ml TGF-β1刺激24 h，再分别加入50、100及200 μmol/L不同剂量棕榈酸作用24 h后，用MTT比色法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡率、免疫细胞化学法测定Caspase-12蛋白表达。结果不同浓度棕榈酸均能抑制细胞增殖（P＜0.05），且随着剂量的增加，细胞相对增殖率（RGR）降低，低、中、高剂量组分别为76.56%、60.93%和34.37%，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。透视电镜发现，不同剂量棕榈酸组出现细胞核变小，细胞出现大量线粒体空泡，染色质边集等典型凋亡表现。空白组、TGF-β1组、TGF-β1+低、中、高剂量棕榈酸组凋亡率分别为（3.32±0.29）%、（1.70±0.14）%、（7.26±0.46）%、（11.24±0.52）%及（15.55±0.31）%，组间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）；随着棕榈酸剂量的增加，细胞Caspase-12蛋白表达增加（P＜0.05）。结论棕榈酸能抑制细胞增殖，增加Caspase-12蛋白表达，促进HSC凋亡。

肝星状细胞；棕榈酸；细胞增殖；细胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（caspase-12）

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是对慢性肝损伤的愈合反应，为一个可逆的过程[1]。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝脏分泌细胞外基质（extra cellular matrixc，ECM）的主要细胞，HSC 激活并转化为肌成纤维细胞样细胞是HF发生、发展的核心环节[2]。而转化生长因子β1（transforming growth factor beta-1，TGF-β1）可以激活HSC并增加多种促纤维化因子的表达，在肝纤维化中起重要作用[3]。如何逆转HF的进程是抗HF研究的重点之一。近年来，针对诱导活化的HSC凋亡成为研发抗HF药物的热点。棕榈酸是一种动植体内常见的高级饱和脂肪酸，有研究报道[4]，棕榈酸刺激巨噬细胞的脂肪细胞脂肪酸结合蛋白（A-FABP）表达增加，可引起巨噬细胞内质网应激和凋亡，从而发挥促动脉粥样硬化作用。亦有研究报道[5-6]，棕榈酸通过内质网应激途径诱导成骨细胞凋亡，且呈浓度和时间依赖性降低成骨细胞增殖活性，增加细胞凋亡，增高细胞内质网应激相关蛋白和基因的表达，但其具体机制目前尚不明确。本研究用棕榈酸作用于经TGF-β1刺激的HSC，观察细胞增殖、凋亡及ERS标志性蛋白Caspase-12的变化，旨在从ERS途径探讨棕榈酸对HSC凋亡的影响，以为HF的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞株

表型为活化的HSC株，从四氯化碳刺激的大鼠肝细胞中分离并获得永生性。

1.1.1 药品与试剂棕榈酸（购自北京百威灵公司），二甲基亚砜（DMSO）、青霉素及链霉素混合液（双抗）（美国Sigma公司生产），胎牛血、DMEM高糖培养基、磷酸盐缓冲液及含体积分数0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）胰蛋白酶（购自美国BI公司），TGF-β1（批号：PHG9204，购自美国Gibco公司），辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗（美国Arigo公司），兔抗鼠Caspase-12一抗（武汉博士德有限公司），FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit Ι（购自美国BD公司）。

1.1.2 仪器3111细胞孵育箱（美国Thermo公司），FACScalibur流式细胞仪（美国贝帝公司），AC24S1生物安全柜（新加坡ESCO公司），TS100F倒置相差显微镜（日本Nikon公司），Universal HoodⅡ凝胶成像分析仪，7500透射电子显微镜（日本Hitachi公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将存放于液氮中的细胞复苏传代培养于含有6%胎牛血清、1%双抗（100 u/ml青霉素、100 μg/ml链霉素）DMEM 高糖培养基中，在37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中进行孵育。当细胞长满密度达到80%时，胰蛋白酶进行传代并接种在细胞培养瓶中。

1.2.2 细胞分组及处理空白组，TGF-β1组，TGF-β1+低、中、高剂量棕榈酸组。空白组加入无血清培养基培养48 h，TGF-β1组加入5 ng/ml TGF-β1作用细胞48 h，TGF-β1+低、中、高剂量棕榈酸组先用5 ng/ml TGF-β1作用细胞24 h，再分别加入50、100及200 μmol/L棕榈酸，培养24 h后检测各项指标的改变。

1.2.3 MTT比色法检测HSC增殖 [7]细胞经常规培养后，以2.5×104个/孔的密度接种于96孔板中，每孔200 μl细胞悬液，每组设置5个复孔并在37℃、5%CO2孵箱中进行孵育48 h，在培养结束前，每孔加入20 μl MTT避光孵育4 h，4 h之后弃去上清液，加入200 μl DMSO，避光震荡10 min后酶标仪490 nm波长处读取光密度值（OD），计算细胞相对增殖率（relative growth rate，RGR）RGR= 实验组OD490/对照组OD490×100%。

1.2.4 透视电子显微镜观察HSC超微结构的改变[8]将细胞处理后进行消化、离心，预冷的PBS洗3遍，戊二醛4℃固定过夜。然后用PBS缓冲液洗2 h，锇酸固定1.5 h，PBS再次清洗2 h，然后依次经过酒精（30%、50%、70%、90%、100%）脱水，树脂包埋，AOE型钻石切片机进行超薄切片，枸橼酸铅，醋酸铀双染，透视电子显微镜观察HSC细胞内超微结构的改变。

1.2.5 AV/PI双染检测HSC凋亡[9]细胞经过处理后，预冷PBS清洗3遍，胰蛋白酶进行消化，离心，沉淀细胞，弃去培养基，预冷PBS再次清洗3遍；预留1/3空白组细胞，不加任何染料，作为阴性对照组，剩下细胞加入1×Binding buffer 195 μl+5 μl An-nexin V，轻轻吹打进行混匀，避光孵育30 min，离心沉淀细胞，弃上清液，加入1×Binding buffer 195μl+5 μl PI，轻轻吹打混匀，之后流式细胞仪检测。

1.2.6 免疫细胞化学法检测HSC内Caspase-12蛋白表达[9]取对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化，接种在带有玻片的6孔板内，按照各处理组操作完成后，将培养板孔中的盖玻片取出，PBS冲洗2次，用4%多聚甲醛固定，按SP法试剂盒操作方法进行Caspase-12蛋白免疫细胞化学染色，DAB显色后，显微镜下观察后摄片。结果判定：以胞浆棕黄色为阳性表达。

图像分析：将染色后的细胞爬片经Image-pro plus专业图像分析系统进行半定量分析，200倍视野下每组图片随机选取6个视野，取其积分光密度值作为Caspase-12蛋白表达。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖情况

经单因素方差分析结果显示，各组OD值比较差异有统计学意义（F=195.25，P=0.000），TGF-β1组与空白组比较OD值增高（P＜0.05）；不同浓度棕榈酸均抑制细胞增殖（P＜0.05），且随着剂量的增加，细胞RGR降低，低、中、高剂量棕榈酸组，组间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 HSC细胞内超微结构的改变

空白组细胞体积较大，轮廓不规则，伸展性好，周缘伸出密集不规则的树枝状伪足。胞内超微结构可见正常微绒毛、线粒体、粗面内质网、游离核糖体和细胞核（见图1A）；TGF-β1组和空白组无差异，有完整的细胞器，细胞核处于分裂相，染色质分布均匀（见图1B）；TGF-β1+低剂量棕榈酸组，细胞表面微绒毛消失，表面平滑，胞浆收缩（见图1C）；TGF-β1+中剂量棕榈酸组染色质凝集、浓缩（见图1D）；TGF-β1+高剂量棕榈酸组染色质密度增加，沿核膜边集，厚薄不均，细胞质内出现大量空泡，细胞核变小等典型细胞凋亡特征（见图1E）。

2.3 各处理组细胞间凋亡率

流式细胞仪检测各处理肝星状细胞凋亡散点图，见图2。经统计学分析显示，不同处理组间细胞凋亡率差异均有统计学意义（F=707.27，P=0.000），TGF-β1组凋亡率低于空白组（P＜0.05）；随着棕榈酸剂量加大，细胞凋亡率增加。见表2。

2.4 HSC内Caspase-12蛋白表达

不同处理组HSC免疫组织化学结果见图3。与空白组比较，TGF-β1组HSC的细胞浆染色深浅不明显（见图3B）；低、中、高剂量棕榈酸细胞浆出现棕黄色，且随着剂量的增加，细胞浆棕黄色逐渐加深（见图3C～E）。与空白组比较，TGF-β1组Caspase-12蛋白表达未见差异（P＞0.05），不同剂量棕榈酸使HSC中Caspase-12蛋白表达增强（P＜0.05）。见表3。

表1 不同处理组HSC吸光度的改变 （n=5，±s）

表1 不同处理组HSC吸光度的改变 （n=5，±s）

注：1）与空白组比较，P＜0.05；2）与 TGF-β1组比较，P＜0.05；3）与TGF-β1+低剂量棕榈酸组比较，P＜0.05；4）与TGF-β1+中剂量棕榈酸组比较，P＜0.05

空白组 1.28±0.13 100.00 TGF-β1组 1.85±0.111） 144.00 TGF-β1+棕榈酸组低0.98±0.081）2） 76.56 195.25 0.000中0.78 ±0.041）2）3） 60.93高0.44 ±0.031）2）3）4） 34.37

图1 透视电子显微镜下各处理组细胞的形态变化

图2 不同处理组HSC凋亡散点图

表2 不同处理组HSC凋亡率的改变 （n=3，%，±s）

表2 不同处理组HSC凋亡率的改变 （n=3，%，±s）

注：1）与空白组比较，P＜0.05；2）与 TGF-β1组比较，P＜0.05；3）与TGF-β1+低剂量棕榈酸组比较，P＜0.05；4）与TGF-β1+中剂量棕榈酸组比较，P＜0.05

空白组 3.32±0.29 TGF-β1组 1.70±0.141）TGF-β1+棕榈酸组低7.26±0.461）2） 707.27 0.000中11.24±0.521）2）3）高15.55±0.311）2）3）4）

图3 各处理组细胞中Caspase-12蛋白的表达（免疫组织化学）

表3 各组HSC中Caspase-12蛋白表达 （n=6，±s）

表3 各组HSC中Caspase-12蛋白表达 （n=6，±s）

注：1）与空白组比较，P＜0.05；2）与 TGF-β1组比较，P＜0.05；3）与TGF-β1+低剂量棕榈酸组比较，P＜0.05

空白组 4 827.12±116.10 TGF-β1组 4 845.49±131.27 TGF-β1+棕榈酸组低6 545.90±205.891） 517.52 0.000中8 352.85±212.461）2）高9 619.55±114.641）2）3）

3 讨论

传统观点认为，HF形成过程中的关键效应细胞是HSC。TGF-β1刺激HSC可作为体外的HF模型，可以用于进行HSC基因表达调控、抗纤维化药物作用及纤维化发生机制等研究[3]。促进活化的HSC凋亡，有助于逆转HF。棕榈酸是一种在生物体内广泛存在的饱和脂肪酸，又称十六烷酸。有结果表明，棕榈酸对βTC6细胞增殖率及胰岛素的合成有抑制作用，并且呈时间-剂量依赖性作用，证实棕榈酸对βTC6细胞的毒性损伤作用[10]。本研究用不同剂量棕榈酸作用于经TGF-β1刺激的HSC，MTT结果显示，低、中、高剂量棕榈酸增殖率依次降低，说明棕榈酸明显抑制HSC增殖。

PARK等[11]发现，HSC经棕榈酸处理后其线粒体和内质网较对照组疏松，当加入Caspase、p53或内质网应激抑制剂能使细胞增殖水平恢复。表明棕榈酸能抑制细胞增殖可能与细胞凋亡、自噬和内质网应激有关。有研究发现[5]，棕榈酸可诱导包括成骨细胞在内的多种细胞凋亡，内质网应激可能参与棕榈酸诱导成骨细胞凋亡过程。

内质网应激反应在棕榈酸诱导的人脐带间充质干细胞、胰岛细胞凋亡中也发挥重要作用[12-14]。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是继死亡受体活化和线粒体损伤之后第3条介导细胞凋亡的信号转导通路。其中ERS有1条特有Caspase-12途径，Caspase-12与其他的Caspases一样以无活性的酶原形式存在。ERS引起Caspase-12激活，激活的Caspase-12切割并激活Caspase-9，活化的Caspase-9激活Caspase-3等效应Caspases，导致细胞凋亡。BITKO等[15]研究发现，由呼吸道合胞病毒引起的A549人肺上皮细胞凋亡与Caspase-12活化及ERS有关。本实验通过免疫组织细胞化学检测法发现，低、中、高剂量棕榈酸上调细胞内Caspase-12表达水平。

研究结果表明，棕榈酸能抑制细胞增殖，增加Caspase-12蛋白表达，促进HSC凋亡。用棕榈酸干预可能为抗纤维化的治疗带来了新的提示。

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Effect of palmitic acid on caspase-12 and proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells*

Ya-nan Li1,Yu Yan2,Ming Wang1,Fang Liu1,Yong-hong Xiao1
(1.College of Public Health,2.College of Clinical Medicine,North China University of Science and Technology;Tangshan,Hebei 063000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of palmitic acid (PA)on caspase-12 and proliferation and apoptosis in rat hepatic stellate cells (HSCs)when stimulated by transforming growth factor-β1(TGF-β1).MethodsHSCs were randomly divided into five groups:Sham group,TGF-β1group,TGF-β1+low PA group,TGF-β1+middle PA group and TGF-β1+high PA group.HSCs were stimulated by TGF-β1(5 ng/ml)for 24 hours followed by co-incubation with PA under different doses(50,100,and 200 umol/L).No intervention was performed in Sham group.Cell proliferation was detected by MTT;morphological manifestations of cells were obtained by transmission electronmicroscope;apoptosis rate was determined by flow cytometry;expression levels of caspase-12 was measured by Immunohistochemistry.ResultsCellular proliferation was significantly inhibited with PA treatment in a dose dependent manner(P＜0.05).Transmission electronmicroscope showed typical apoptotic features such as small nuclei,large numbers of mitochondria vacuoles and obvious edge sets of DNA.Treatment of PA dramatically increased apoptosis rate when compared with TGF-β1group[(7.26±0.46)%vs(1.70±0.14)%,P＜0.05;(11.24±0.52)%vs(1.70±0.14)%,P＜0.05;(15.55±0.31)%vs(1.70±0.14)%,P＜0.05].Expression of caspase-12 protein increased significantly with PA in dose dependent manner (P＜0.05).ConclusionPA inhibits cellular proliferation through promoting caspase-12 mediated apoptosis in HSCs.

hepatic stellate cell;palmitic acid;proliferation;apoptosis;caspase-12

R575.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.30.003

1005-8982（2017）30-0015-06

2017-07-08

河北省自然科学基金资助项目（No：H2015209043）

肖永红，E-mail：kycxyh@tom.com；Tel：0315-8805226

（王荣兵 编辑）