山仔水库主要水华蓝藻种类的分离与鉴定

周志华+翁笑艳+舒惠琳+庄惠如

摘要：以福州山仔水库蓝藻发生期的水样为材料，分离获得了2株形态不同的蓝藻。在形态学鉴定的基础上，进一步以16SrRNA基因为分子标记，对分离获得的2株水花蓝藻进行了分子鉴定。结果显示：山仔水库夏秋发生的水华优势种为铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa ），春末发生的水华优势种为浮游鱼腥藻（Anabaena planctonica ）。研究首次对山仔水库不同季节的水花蓝藻种类进行了生物鉴定，其结果可为蓝藻水华的监测与防治提供基础性资料。

关键词：山仔水库；蓝藻水花；分子鉴定

中图分类号：X52

文献标识码：A 文章编号：16749944（2017）22001304

1 引言

水华是淡水水体富营养化进程中形成的有害现象，是湖库生态系统退化的典型表征。蓝藻是最简单、最原始的的原核生物之一，是形成水花的最常见物种。已知蓝藻约有2000多种，由于蓝藻具有极强的适应性，分布极广，因此也具有较高的遗传多样性。

山仔水库是福州市及其周边地区的第二饮用水源地。山仔水库自2000 年首次发现蓝藻水华以来，蓝藻水华现象常年频发[1，2]。本课题在生态调研中，发现库区的水华优势种有明显的季节更替现象。根据形态特征初步判断水华优势种为微囊藻属（Microcystis）和鱼腥藻属（Anabaena）的种类[3，4]。传统的藻类种类鉴定方法主要是依据形态学特征进行鉴定。由于蓝藻不同物种间的差别十分细微，且环境因素对藻体的形态也有很大的影响，因此，在光学显微镜下，蓝藻种类的鉴定存在一定的困难与偏差。此外，鱼腥藻属的定种一般需要孢子的形态特征，而本次调研没有发现孢子，故形态上无法定种。因此有必要进一步进行分子鉴定。

分子生物学方法由于操作容易、结果可靠，已被广泛应用在环境微生物群体的测定和鉴别上。目前用于蓝藻分子鉴定和系统发生研究的方法主要有核糖体的16SrRNA和ITS等基因，并取得一定效果[5，6]。本专题在山仔水库蓝藻水华爆发期间，分离纯化获得两株水华蓝藻。在形态分类的基础上，进一步提取水华蓝藻的基因组DNA，克隆其16SrRNA基因并进行测序，将测序结果提交GenBank，构建系统进化树，以确定两种水华蓝藻的遗传属性。

2 材料与方法

2.1 藻株分离纯化

于2015年4月至2016年5月的水华发生期间，在山仔水库蓝藻水华聚集处用浮游生物网多次采集带有蓝藻水华的水样。获取的水样立即送往实验室进行细胞分离。 丝状体种类采用毛细管分离法；单细胞和群体类型的种类则采用平板分离法。

分离后的藻细胞经多次平板分离纯化，最后挑取纯化后的单藻落用锥形瓶进行扩培。培养用BG11培养基，于恒温光照培养箱保种培养，光强为1500～2000 lx，光暗周期12：12 h，温度控制为25±1 ℃。

2.2 形态分类鉴定

分别取水华发生期的水样和分离纯化藻株的培养物制成临时水装片，直接于Olympus BX51型光学显微镜下观察、拍照，并根据有关文献[7，8]进行形态分类鉴定。

2.3 分子生物学鉴定

将分离纯化后的藻株富集培养，取生长期藻细胞用DNA试剂盒提取蓝藻基因组DNA。用于扩增蓝藻16SrRNA的引物为原核生物通用引物（由铂尚生物公司合成）。PCR扩增产物由1%的琼脂糖凝胶电泳检测，产物由上海生工进行测序。测序结果通过NCBI的BLAST进行比对，并将测序结果和从Genebank上下载的序列通过分子进化遗传分析软件Mega5.05进行对位排列，并采用邻接法（NJ）构建分子系统树。

3 结果与分析

3.1 两株水华蓝藻形态特征

在山仔水库蓝藻水华发生期间，直接采集水华样品进行光学显微观察，镜检结果发现，春季发生的优势种类为一种丝状体型的蓝藻；夏秋发生的优势种类为不定型胶群体蓝藻。两种水华蓝藻种类的形态特征如下。

（1）群体体型的优势种类（见图1）。其藻体呈橄榄绿色，为不规则团块状，或形成穿孔的网状团块胶群体。群体胶被无色透明，边缘部份水化。细胞球形、近球形，直径约3～5 μm。群体中细胞分布均匀，有时密贴。细胞原生质体灰绿色、蓝绿色，具伪空泡（气囊）。根据相关文献对微囊藻属种的描述，其形态特征与铜绿微囊藻种类接近。故初步鉴定为铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa ）。

（2）丝状体型的蓝藻（见图2）。藻体单生，无明显胶被。藻丝直或稍微弯曲，末端不变细。营养细胞球形或扁球形，宽为7.7～11.4 μm，长约4.9～11.4 μm，细胞具气囊。异形胞为球形或扁球状，直径约8.3～10.7 μm，未发现有孢子。从藻体形态来看，该丝状蓝藻与文献[9]中鱼腥藻属的形态特征描述相符。由于未发现孢子，而孢子的形态、位置是鱼腥藻属的定种依据之一，故只能初步鉴定山仔水库的丝状蓝藻为鱼腥藻（Anabaena sp.）。

3.2 两株水华蓝藻16SrRNA序列

经分离纯化后，获得2株纯化培养物。胶群体型和丝状体型的水华优势藻分别编号为：藻株B1-14和藻株B1-15。取生长期藻细胞分别提取不同藻株的基因组DNA，并扩增蓝藻16SrRNA。PCR产物经电泳和溴化乙锭染色后，两种蓝藻都具有明亮的条带（图3），大小均在1000bp和2000bp之间，与预想的结果一致，因此可基本断定它们就是目的片段。

3.3 两株水华蓝藻16Sr RNA同源性分析

将上述的序列提交GenBank，分别得到两者的登录号， 藻株B1-14的登录号为KP635086， 藻株B1-15的序列号为KP635087。将两者的16SrRNA与NCBI中的序列进行Blast，结果显示，藻株B1-14的16SrRNA序列与微囊藻属的铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）具有99%的同源性；藻株B1-15的16SrRNA序列與鱼腥藻属的浮游鱼腥藻（Anabaena planctonica）具有99%的同源性。由系统进化树可以看出（图4、5），山仔水库分离的藻株B1-14与M.aeruginosa的进化关系最近，与其它Microcystis sp.的亲缘关系较远；藻株B1-14与A. planctonica 的进化关系最近，与其它Anabaena sp.的亲缘关系较远。结合形态分类鉴定，可以确定这两株分离自山仔水库的水华优势种为铜绿微囊藻和浮游鱼腥藻。分别定名为Microcystis aeruginosa B1-14和Anabaena planctonica B1-15。endprint

4 讨论与结论

浮游植物种类鉴定不仅是水生生态学研究的基础，更是水环境监测和水华预警中不可缺少的环节。以山仔水库蓝藻发生期的水样为材料，分离获得2株形态不同的蓝藻。在形态学鉴定的基础上，进一步以16SrRNA基因为分子标记，对分离获得的2株水花蓝藻进行分子鉴定。鉴定结果表明：山仔水库2015年4月至2016年5月期间，夏秋发生的水华优势种为铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa ），该种类隶属于蓝藻门（Cyanophyta）、 蓝藻纲（Cyanophyceae）、色球藻目（Chroococcales）、色球藻科（Microcystaceae），微囊藻属（Microcystis）。山仔水库春末发生的水华优势种为浮游鱼腥藻（Anabaena planctonica ），该种类隶属于蓝藻门（Cyanophyta）、蓝藻纲（Cyanophyceae）、念珠藻目（Nostocales）、念珠藻科（Nostocaceae）、鱼腥藻属（Anabaena）。两者均属于普生性种类，是最常见的水华蓝藻。

在湖泊、水库等淡水水体中，产生水华的主要优势种大多是蓝藻门的微囊藻属和鱼腥藻属的种类。已有的研究报道中[2，10，11]，山仔水库蓝藻水华优势种主要是水华微囊藻（Microcystis flos-aquae）。水华微囊藻与铜绿微囊藻在群体外形上比较相似，尤其是幼龄期的群体更难加以区别。但水华微囊藻的成熟期群体不形成穿孔的网状胶群体，群体内的细胞排列比较密集，因此，本次调研中微囊藻样品的形态学特征与此不符。此外，通过分子生物学鉴定，结果也佐证了山仔水库夏秋季节的主要水华优势种为铜绿微囊藻而非水华微囊藻。

本研究结果还显示，山仔水库不同种类的蓝藻水花具有明显的季节更替现象。夏秋季节库区的主要水华优势种为铜绿微囊藻，而春末库区水花的优势种类为浮游鱼腥藻。笔者认为，对水花蓝藻种类的鉴定，仅仅依据一两次的取样和形态鉴定，显然是有局限性的，因此，采集有效的水样，以及采用多种现代生物技术手段对水花蓝藻进行种类鉴定是很有必要的。本研究首次对山仔水库不同季节的水花蓝藻种类进行生物鉴定，研究结果可为山仔水库蓝藻水华的监测与防治提供可靠的基础性资料。

参考文献：

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[10]苏玉萍， 郑达贤， 陈娜蓉，等. 环境因子对福建省山仔水库水华微囊藻生长的影响[J]. 植物资源与环境学报，2005， 14（3）：42～46.

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Abstract： In this paper， the water samples of cyanobacteria bloom in Fuzhou Shanzai reservoir were used as materials. Two strains of blue-green algae in different morphologywere isolated from the water samples.On the basis of morphological identification， the 16SrRNA gene was further used as molecular marker to identify 2 blue-green algae.The results showed that the dominant species of bloom in summer and autumn wasMicrocystis aeruginosa. The dominant species of water bloom in late spring is Anabaena planctonica.For the first time， the species of cyanobacteria in different seasons were evaluated by bioassay. The results can provide basic data for monitoring and controlling cyanobacteria bloom.

Key words： Shanzai reservoir； cyanobacteria bloom； molecular identificationendprint