苦蘵组织培养技术初探

邱 胜，卢江杰，2，王慧中，2，李 菁，刘玉洋，贺超英

(1． 杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036； 2． 浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室，浙江 杭州 310036； 3． 中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室，北京 100093)

苦蘵组织培养技术初探

邱 胜1，卢江杰1，2，王慧中1，2，李 菁3，刘玉洋1，贺超英3

(1． 杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036； 2． 浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室，浙江 杭州 310036； 3． 中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室，北京 100093)

为建立药用植物苦蘵稳定高效的组织培养体系，以苦蘵的子叶为外植体进行离体培养，对培养条件进行探索和优化.结果表明：苦蘵种子在1/2 MS培养基中萌发可培养出适于后续试验的健康子叶；诱导愈伤组织和不定芽的最佳培养基为含6-BA(3 mg/L)和NAA(0.05 mg/L)的MS培养基，其愈伤组织诱导率达100%，从愈伤组织诱导不定芽率最高达78%；将生长良好的2～3 cm的不定芽接种到1/2 MS生根培养基中，两周左右可形成较好的根系，生根率可达100%.

苦蘵；子叶；组织培养；植株再生；最佳培养基

苦蘵(PhysalisangulataL.)为茄科酸浆属一年生草本植物，分布于华东、华中、华南及西南，印度、越南、日本、澳大利亚和美洲均有产[1].苦蘵以果、根或全草入药，性味苦、寒，主治咽喉肿痛、腮腺炎、急慢性气管炎、肺脓疡、痢疾、小便不利、外用治脓泡疮等.苦蘵主要含有醉茄内酯、酸浆苦素、黄酮、生物碱及甾醇等化学成分[2-3]，其中酸浆苦素和谷甾醇具有多种体内外的抗癌活性，对于宫颈癌和皮肤癌都具有明显疗效[4].

植物组织培养技术是当今生物工程中的一个重要组成部分，已得到广泛应用.苦蘵作为一种药用植物，具有潜在抗癌效果，而且还具有生长周期短、单株种子多、近缘物种(番茄、马铃薯、辣椒和茄子)参考基因组多等特点，便于进行遗传转化和基因功能研究，在作为药用植物基因工程受体模式植物方面具有广阔的前景.目前，关于苦蘵的研究主要集中在有效成分分析及药理研究方面[5-7].虽然同属植物酸浆和毛酸浆的组织培养研究较多[8-10]，但对苦蘵组织培养及遗传转化方面的研究和应用微乎其微[11].本试验以苦蘵幼苗子叶为外植体，对离体培养条件进行探索和优化，以期为苦蘵的快速繁殖、优良种质资源保护和新品种选育奠定基础，同时为苦蘵遗传转化体系构建、抗肿瘤活性成分及其代谢途径相关的基因功能验证和利用提供技术支撑.

1 材料与方法

1.1 植物材料

试验材料为浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室收集的浙江浦江野生种源，种植在杭州师范大学下沙校区试验地.取苦蘵成熟果实后剥开，洗出种子，硅胶干燥并保存于实验室4 ℃冰箱备用.

1.2 培养基

种子萌发培养基：1/2 MS培养基；诱导愈伤培养基：含NAA和6-BA的MS培养基，pH为5.8，根据试验设计要求在培养基中添加不同的植物生长调节剂；生根培养基：1/2 MS培养基，含NAA 0.1 mg/L的MS培养基和含NAA 0.2 mg/L的MS培养基.

配制每升MS基本培养基需加4.74 g MS培养基干粉(鼎国，北京)，30 g蔗糖，一定浓度的6-BA和NAA，定容至1 L后调pH至5.8～6.0，加8 g琼脂粉(终质量分数0.8%)，然后高压灭菌(121 ℃，20 min)，待培养基冷却至60 ℃左右时，倒板，备用.

1.3 种子萌发

选取颗粒饱满的种子进行试验.种子在95%乙醇中摇晃浸泡5 min.再加入20%(体积分数)次氯酸钠，0.1%(体积分数)吐温20，继续浸泡20 min.倒净液体后，用无菌的ddH2O清洗种子3～5次.将种子均匀播种在含1/2 MS培养基的玻璃培养皿上，用Parafilm膜封口后置于培养室中进行培养，培养温度为(25±1) ℃，光周期为16 h光照/8 h黑暗，培养2周左右，待长出真叶，获得无菌苗，用于后续实验.

1.4 最适生长调节剂浓度组合的筛选

选取苦蘵种子萌发2周时的幼苗子叶为外植体.剪去子叶两端，接种于诱导分化培养基上.在基本培养基中添加不同配比的植物生长调节物质：细胞分裂素6-BA(0～3.0 mg/L)和生长素NAA(0～0.2 mg/L).共设10个组合，每组合3个重复，每重复接种30个叶盘.培养条件同上.40 d后统计愈伤组织和不定芽诱导率：

愈伤组织诱导率/%=诱导出愈伤的叶盘数/接种的叶盘数×100；

不定芽出芽率/%=长出芽的愈伤数/接种的愈伤数×100.

1.5 生根培养及移栽

待愈伤上的不定芽长到2～3 cm时，剪下小苗，将其插入生根培养基中.继续培养，待小苗长出白色且粗壮的根后，进行驯化移栽.首先在培养室将瓶盖打开炼苗2～3 d，然后取出植株，洗净根部培养基，移栽.移栽条件：营养花卉土∶蛭石=3∶1，光照培养箱，16 h 光照，26 ℃.

2 结果与分析

表1 不同生长调节剂浓度配比对苦蘵子叶不定芽分化的影响Tab.1 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA in shoots-inducing medium on the induction of shoots from P. angulate cotyledon

注：10个组合均以MS为基本培养基；不同小写字母表示各处理间差异显著(P<0.05).

2.1 苦蘵种子的萌发

苦蘵种子在自然条件下播种发芽率较低，但在组织培养环境下萌发率极高.在1/2 MS基本培养基中培养5 d后，种子的胚根开始出现.如图1B所示，2周后，绝大多数幼苗已形成子叶，并长出较为发达的根系，可用于后续试验.

2.2 最适生长调节剂浓度组合的筛选

如表1所示，采用10种不同培养基组分对苦蘵的植株再生能力进行研究.培养1周左右后，叶盘开始加厚.约3周后，愈伤组织上有芽开始萌发(图1D).当MS基本培养基中不添加任何生长调节剂时(表1中编号1，即试验对照组)，叶盘诱导愈伤组织的生长状态差，一周左右叶盘周围仍未见有须根长出，诱导率为0.当6-BA质量浓度为3 mg/L、NAA为0.05 mg/L(编号8)时，不定芽诱导率达到77.78%，高于6-BA 3 mg/L、NAA 0.1 mg/L(编号9)时不定芽的诱导率73.33%； 6-BA为2 mg/L、NAA为0.2 mg/L(编号7)时，不定芽诱导率为66.67%；而6-BA为3 mg/L、NAA为0.2 mg/L(编号10)时，不定芽诱导率为62.22%；其他处理条件下的出芽率均低于50%.可见，合适浓度的6-BA和NAA对不定芽的诱导起着关键作用，不同浓度的生长调节剂在一定程度上影响不定芽的数量和质量.因此，本研究中苦蘵再生的最佳培养基为：含6-BA 3 mg/L和NAA 0.05 mg/L的MS培养基.

2.3 生根培养及移栽

如图1F所示，培养两周后，1/2 MS培养基中不定芽生根率达100%，根的生长状态较好，主根系和须根分明.含NAA 0.1 mg/L和0.2 mg/L的MS培养基中，培养材料的周围长出较密的1～3 cm须根，呈辐射状.低盐的培养基有利于生根培养，这与一般植物生根培养时需要低盐浓度培养基的结论[12]一致.1/2 MS及含有0.1 mg/L NAA的1/2 MS两种培养基中的植株，移栽后成活率均较高，但1/2 MS中的植株由于根系较为发达，植物长势较快.因此，本研究中苦蘵生根的最佳培养基为1/2 MS.

2.4 移栽幼苗的生长情况

移栽具有发达健壮根系的幼苗到混匀的花土和蛭石(2∶1)无菌基质中培养，其成活率可达98%以上；出瓶一周后可达10片叶子以上(图1G)，3～4周后能开花，并陆续结果(图1H，1I).

A: 苦蘵种子0 d；B: 苦蘵2周的小苗；C: 叶盘0 d；D: 叶盘21 d；E: 叶盘32 d；F: 芽生根培养12 d； G: 出瓶后1周的幼苗；H: 苦蘵组织培养成熟植株；I: 组织培养成熟植株的花与果.图中标尺为1 cm.图1 苦蘵组织培养体系不同阶段Fig. 1 Different stages of tissue culture for Physalis angulata L.

3 讨论

3.1 选择合适的种子消毒方法

由于取材时苦蘵种子表面带菌，为了获得实验所需的无菌苗，种子萌发前需进行消毒.消毒的关键是选择合适的消毒剂及其浓度和消毒时间.消毒剂杀灭种子表面微生物的同时，也会对外植体产生一定的伤害.唐琳等[13]指出，经0.1%升汞和3%～4%次氯酸钠溶液分别消毒后的番茄种子在最先出芽时间、子叶形成时间及全部出芽时间上均有极显著差异，番茄种子消毒以3%～4%次氯酸钠溶液最佳.本试验中苦蘵种子在95%乙醇中摇晃浸泡5 min；再加入20%乙醇体积的次氯酸钠和0.1%乙醇体积的吐温20，继续浸泡20 min.倒净液体后，用无菌的ddH2O清洗种子3～5次，消毒效果较好.这说明不同培养材料消毒方法有差异.

3.2 苦蘵组织培养中外植体的选择

最佳外植体是组织培养成功的一个关键因素，外植体的年龄、发育阶段、生长环境，选取部位和时间都可能导致外植体生理、生化状态的差异，从而影响植物组织培养的效果.一般来说，与由成熟的及高度分化的细胞组成的器官相比，分化程度较轻的细胞组成的器官具有较高的再生能力.据报道，酸浆属植物的成熟叶盘、下胚轴、上胚轴、叶片基部、子叶及根尖等的切片均可用于愈伤组织的诱导[13]，如：粘果酸浆(P.ixocarpa)以根尖为外植体诱导出愈伤组织[14]；秘鲁酸浆(P.peruviana)以叶片为外植体进行体外再生体系的研究[15]；陈明波等[8]在以酸浆(P.alkekengi)的叶片、叶柄、茎段、子叶、胚轴、胚根为外植体进行离体培养的研究中，发现叶柄为酸浆不定芽分化的最佳外植体类型；以通肯酸浆(P.tungkenensis)无菌苗的子叶为外植体进行组织培养和植株再生的研究中，愈伤组织率、分化率最高达85%，且能形成大量健壮的不定芽，有利于快速繁殖[10]；以毛酸浆(P.pubescens)无菌苗的子叶为外植体也能诱导出再生植株[9].比较已有的文献，在酸浆属植物组织培养中，子叶经常作为外植体使用，而且愈伤和分化的频率较高.因此，本试验中直接选择苦蘵无菌苗的子叶为外植体进行研究.1周左右叶盘开始加厚，进一步培养3周左右，愈伤组织表面开始分化出绿色芽点，并进一步发育形成不定芽，诱导率最高接近78%.可见，苦蘵无菌苗的子叶适宜作为外植体进行组织培养繁殖.

3.3 苦蘵组织培养中生长调节剂的作用

植物生长调节剂中的细胞分裂素和生长素类物质在植物的再生和诱导愈伤组织形成的过程中具有重要的作用.细胞分裂素类具有促进细胞分裂和分化、诱导芽的形成和生长以及显著改变其他内源激素作用等特点.生长素类物质则在愈伤组织的诱导、胚状体的产生以及试管苗的生根方面有重要作用.然而两者比例是关键.

本研究中，当MS培养基中不添加任何植物生长调节剂时，苦蘵子叶叶盘不增厚，无法形成愈伤，一周后在叶盘周围长出许多须根.而其他9组高浓度6-BA和低浓度NAA配比组合的培养基中，均能由子叶叶盘成功诱导出愈伤组织，诱导率为100%.但不同的生长调节剂组合，愈伤组织的出芽率存在明显差异.如表1所示，当6-BA为1 mg/L和2 mg/L时，随着NAA浓度的增加，愈伤组织的出芽率升高.而当6-BA为3 mg/L时，随着NAA浓度的升高，愈伤组织的出芽率反而有所降低.由此可见，合适的生长调节剂浓度配比相当重要，为达到最高的出芽率，最适的生长调节剂配比为：3 mg/L 6-BA加0.05 mg/L NAA.这样在一个培养基上就可以完成常规的愈伤诱导和不定芽诱导两个步骤，不但能保证较高的不定芽诱导率，而且缩短了实验周期，减少了污染率.

苦蘵植株的生根较容易，不需要额外的生长调节剂，在普通的1/2 MS培养基中培养2周左右即可形成较好的根系.所以其生根培养基为1/2 MS培养基.

至此，苦蘵的高效、快速组织培养体系已建成.

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TissueCultureSystemforPhysalisAngulataL.

QIU Sheng1, LU Jiangjie1, 2, WANG Huizhong1, 2, LI Jing3, LIU Yuyang1, HE Chaoying3

(1. College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China; 2. Zhejiang Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement and Quality Control of Medicinal Plants, Hangzhou 310036, China; 3. State Key Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany, Institute of Botany-Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China)

In order to establish a stable and effective tissue culture system inPhysalisangulateL., in vitro culture of the cotyledons ofP.angulatewas made, and the culture conditions were explored and optimized. The results showed that the seeds ofP.angulatecould culture healthy cotyledons which were fit for the follow-up tests in 1/2 MS culture medium; the callus induction rate reached 100% and the adventitious bud rate reached 78% within the best culture medium of induced callus and adventitious buds, which contained MS 6-BA 3 mg/L, NAA 0.05 mg/L. The powerful rooting rate of regenerated plants was up to 100% when 2～3 cm well-grown adventitious bud was inoculated into 1/2 MS rooting medium within a period of two weeks.

PhysalisangulataL.; cotyledon; tissue culture; plant regeneration；optimum medium

2017-05-19

国家自然科学基金项目(31470407)；浙江省公益技术计划项目(2014C32090).

卢江杰(1982-)，男，讲师，博士，主要从事药用植物分子生物学研究.E-mail:lujj@hznu.edu.cn

10.3969/j.issn.1674-232X.2017.06.008

Q94

A

1674-232X(2017)06-0613-05