MiR-195对BEL-7402/5-FU细胞5-氟尿嘧啶耐药性的影响

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(南华大学药物药理研究所，湖南 衡阳 421001)

·基础医学·

MiR-195对BEL-7402/5-FU细胞5-氟尿嘧啶耐药性的影响

杨晓燕，向琼，殷杰，虞佳，甘润良，雷小勇*

(南华大学药物药理研究所，湖南 衡阳 421001)

目的探讨miR-195对BEL-7402/5-FU细胞5-氟尿嘧啶药物敏感性的影响。方法采用qRT-PCR检测BEL-7402细胞与BEL-7402/5-FU细胞中miR-195的表达水平。将miR-195质粒载体瞬时转染至BEL-7402/5-FU细胞；MTT检测细胞药物敏感性的改变。结果相比于BEL-7402细胞，miR-195在BEL-7402/5-FU细胞中表达水平下调；miR-195转染组的细胞增殖抑制率较miRNA阴性对照组及未转染组明显增高。结论MiR-195能够增加BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶的药物敏感性，抑制细胞增殖。

MiR-195； BEL-7402/5-FU细胞； 5-氟尿嘧啶； 耐药性

原发性肝癌是全球范围内发病率高且最为常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居全球恶性肿瘤的第二位[1]。目前，化疗是原发性肝癌综合治疗中常用的一种方法。5-氟尿嘧啶对增殖性细胞具有杀伤性作用而作为一线药物。它通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，进而阻断DNA的生物合成而抑制肿瘤细胞增殖[2]。因此，在肝癌的化疗方面如何提高肿瘤对化疗药物的敏感性及增强药物疗效，具有重要意义。miRNA是一类小的非编码调节RNA分子，长度为18～25个核苷酸[3]。最近的研究证实，miRNA参与作用肿瘤细胞耐药的过程[4]。MiR-195是miR-15/16/195家族成员之一，作为抑癌基因在肿瘤发生中起着重要作用，它可能是肿瘤治疗的潜在靶点[5]。本研究利用miR-195质粒表达载体转染至肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU细胞中，探讨miR-195在肝癌细胞化疗耐药过程中所发挥的作用，从而为逆转肝癌耐药提供新途径。

1 材料与方法

1.1材料与试剂人肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU 细胞购自南京凯基生物有限公司，1640粉末培养基购自美国GIBCO公司，胎牛血清为杭州四季青生物公司，质粒提取试剂盒为日本TAKARA 公司产品，脂质体Lipofectamin2000 为美国Invitrogen产品，RT-PCR 试剂盒购自Promega公司，PCR 扩增体系购于上海生物工程公司。5-氟尿嘧啶为天津金耀氨基酸有限公司，MTT为Sigma 公司(将5 mg的MTT溶于0.5 mL)。

1.2 BEL-7402/5-FU细胞培养BEL-7402/5-FU细胞培养于10%胎牛血清的RPMI1640溶液中，置于37 ℃，5%二氧化碳培养箱，在培养液中加入0.15 mmol/L 5-FU维持耐药性培养。细胞经传代和收集，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 qRT-PCR检测BEL-7402/5-FU细胞miR-195表达水平qRT-PCR检测BEL-7402/5-FU细胞与BEL-7402细胞中miR-195表达水平。采用RNA 提取试剂盒提取细胞总RNA，逆转录实验流程参照RT-PCR 试剂盒的说明书进行，PCR 反应体系按照说明书要求分别加入引物：U6 和hsa-miR-195，反应条件均为：95 ℃，10 min；40个PCR 循环(95 ℃，15 s；60 ℃，60 s 收集荧光)。为了建立PCR 产物的熔解曲线，扩增反应结束后95 ℃，2 min；60 ℃，20 s；99 ℃，10 s，并从60 ℃缓慢加热到99 ℃(8 min) 。BEL-7402/5-FU细胞与BEL-7402细胞样品中的miR-195 和内参(U6) 分别进行实时定量RT-PCR 反应。数据采用2-△△CT法对数据进行统计分析。

1.4真核质粒表达载体构建与BEL-7402/5-FU细胞转染真核质粒表达载体构建：线性化PcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR表达载体含有绿色荧光蛋白(GFP)从上海吉玛公司购得。基于线虫miR-67(与人源的miRNA无同源性)设计阴性对照组。

质粒提取：将构建好的miR-195质粒表达载体和阴性对照组表达载体(载体上含Streptomyces spectabilis耐药筛选基因)，转化进入大肠杆菌表达菌株(JM109)进行扩增，利用质粒提取试剂盒(去内毒素)提取质粒，-80 ℃保存备用。

BEL-7402/5-FU细胞转染：根据脂质体Lipofectamine 2000产品说明书进行，取对数期细胞接种于6孔板，6 000个细胞/每孔，待细胞生长至占孔面积为80%左右进行转染。弃去旧培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞3次。制备miRNA质粒/脂质体复合物，6孔板每孔试剂用量如下：取10 μL脂质体至100 μL优化培养基(OPTI_MEM)中充分混匀，室温静置5 min；同时4 μg质粒载体至100 μL优化培养基(OPTI_MEM)中混匀，室温静置5 min；用移液枪将两种混合物轻轻混合至均匀，室温静置20 min，此即为miRNA/脂质体复合物。用移液枪将miRNA/脂质体复合物轻滴入到孔中，37 ℃培养箱培育6 h后，每孔补加1 000 μL完全培养基(含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液)培养细胞。转染48 h后，利用倒置荧光显微镜观察细胞转染率。

1.5 MTT检测BEL-7402/5-FU细胞增殖变化待细胞呈指数式生长，取细胞接种于96孔板，6.0×103个细胞/孔，接种12 h后，进行质粒转染，96孔板每孔试剂加入量如下：取1 μL脂质体(Lipofectamine 2000)至10 μL优化培养基(OPTI_MEM)中，混匀充分，室温静置5 min；同时取0.4 μg 质粒 (miR-195或miRNA阴性对照质粒)至10 μL优化培养基(OPTI_MEM)，混匀充分，室温放置5 min；然后，将两种混合物均匀混合，室温静置20 min即得到miRNA/脂质体(Lipofectamine 2000)复合物。37 ℃培养箱培育24 h后，每孔分别加入0、0.1、1、10、100 mmol/L 5-氟尿嘧啶的完全培养基150 μL，再培养24 h后加MTT(5 g/L)20 μL/孔，再培养4 h，弃去上清液，加DMSO 150 μL/孔，微量振荡器振摇10 min后，在酶标仪570 nm波长下测OD值。根据公式计算：增殖抑制率=1-(试验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)，并计算各实验组细胞的IC50值。

1.6统计分析所有实验数据均采用均数±标准差表示，SPSS 18.0软件进行统计，单因素方差分析、方差齐性检验，并经LSD 检验，P<0.05 为差异有显著性。

2 结 果

2.1 qRT-PCR检测细胞miR-195表达水平在BEL-7402/5-FU细胞中miR-195表达较BEL-7402细胞显著下调(比值<0.5)(见图1)。

图1 BEL-7402/5-FU细胞与BEL-7402细胞中miR-195的表达 与BEL-7402细胞比较，*p<0.05(n=3)

2.2倒置荧光显微镜检测miR-195转染BEL-7402/5-FU细胞的转染率质粒表达载体测序结果表明miR-195序列位于载体122-140 bp间，确定载体构建成功(图2)。miR-195转染BEL-7402/5-FU细胞后48 h，通过倒置荧光显微镜检测转染细胞的荧光情况，miR-195转染组及阴性对照组转染率均大于35%(图3)。

图2 miR-195重组PcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体测序图

图3 倒置荧光显微镜检测miR-195 转染BEL-7402/5-FU细胞的转染情况(×100) A:未转染组;B:miRNA阴性对照组;C:miR-195转染组

2.3 MiR-195联合5-FU对BEL-7402/5-FU细胞增殖的影响MTT法观察细胞生长的变化(见图4)；miR-195转染组5-氟尿嘧啶的IC50值7.5±1.43 mmol/L；未转染组的IC5072.67±9.87 mmol/L及阴性对照组IC5068.84±8.56 mmol/L。与未转染组和阴性对照组比较，miR-195转染组的IC50值显著降低。

图4 miR-195联合5-FU 处理对BEL-7402/5-FU细胞增殖的影响 与未转染组&阴性对照组，*P<0.05(n=3)

3 讨 论

5-氟尿嘧啶(5-FU)是肝癌及其他肿瘤化疗中使用最为广泛的药物，然而，由于肿瘤细胞原发或继发的耐药性，化疗的效果差强人意。其耐药性涉及细胞的多种生化改变，包括耐药相关基因表达升高、药物的蓄积降低、谷胱甘肽(GSH) 或与其代谢有关酶活性增高、细胞内金属硫蛋白水平升高以及DNA 修复能力增强等。因此，临床上单用5-FU对耐药的肿瘤细胞疗效很差。为逆转5-FU的耐药性，人们进行过广泛的探讨，但至今尚未发现一种在体内有良好逆转5-FU耐药性的药物。

越来越多的研究证实miRNA突变或者异常表达与多种人类癌症发生相关，有关于miRNA的研究工作也成为近年来生命科学领域一个热门的研究聚焦点。miRNA的表征有望成为肿瘤诊断和预后的生物学标记。此外，miRNA特异性调控靶基因的作用方式，可能为抗肿瘤治疗提供新的方法[6]。本研究探讨miRNA在化疗耐药过程中所发挥的作用，有望发现一个行而有效的化疗策略。

本研究发现BEL-7402/5-FU细胞系与BEL-7402细胞系之间miRNA存在表达差异。其中某些miRNA变异与肿瘤发生发展密切关联，如miR-195[7]、miR-122[8]、miR-372[9]、miR-16等[10]miRNAs在肿瘤的生物学特性中发挥的重要作用也可能参与肿瘤耐药。本文以BEL-7402/5-FU 为研究对象，qRT-PCR结果显示，BEL-7402/5-FU 细胞中miR-195表达较BEL-7402 细胞显著降低，提示miR-195与肝癌的耐药性密切相关。本研究利用构建的miR-195真核表达载体，调整修复了BEL-7402/5-FU细胞系中miR-195的表达水平。结果表明经转染后，miR-195均能增加化疗药物的敏感性，进而逆转BEL-7402/5-FU细胞对5-FU耐药。

这一研究提示，miR-195很可能成为抗肿瘤治疗的一个有效靶点，尤其在抗肿瘤治疗及肿瘤耐药方面占据重要地位，并能够增强BEL-7402/5-FU对5-FU化疗药物的敏感性，促进肝癌细胞凋亡，为肝癌的基因治疗提供了新的途径；为了进一步明确其逆转耐药的具体机制，还需要验证miR-195对其它多种化疗药物敏感性的影响以及进行体内成瘤动物实验，为miR-195用于临床打下实验基础。如果能够成功应用miRNA作为抗肿瘤治疗制剂于临床上，虽然能够带来巨大的经济与社会效益，但是将面临miRNA在体内的给药方式等障碍，因此，将基础研究工作应用到临床的生物治疗有待深入探讨。

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EffectsofMicroRNA-195on5-FUResistanceinBEL-7402/5-FUCells

YANG Xiaoyan,XIANG Qiong,YIN Jie,et al

(InstituteofPharmacyandPharmacology,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveThis study investigated the effect of miR-195 on 5-FU resistance in BEL-7402/5-FU Cells.MethodsqRT-PCR analyzed expression of miR-195 between BEL-7402 and BEL-7402/5-FU cells.MiR-195 was transiently transfected into BEL-7402/5-FU cells.Drug sensitivity of the cells to 5-FU was analyzed by MTT.ResultsThe expression of miR-195 was downregulated in BEL-7402/5-FU cells compared to parental BEL-7402 cells．MTT results showed that miR-195 transfected cells had a higher cell inhibition rate than untreated cells or negative control.ConclusionsMiR-195 could sensitize BEL-7402/5-FU cells to 5-FU and inhibited cell proliferation.

MiRNA-195; BEL-7402/5-FU cells; 5-FU; drug resistance

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.01.008

2016-04-10；

2016-09-21

国家自然科学基金资助(81372579);湖南省卫生厅医药卫生资助科研项目(B2014-048);湖南省教育厅一般课题(13C832).

*通讯作者，E-mai:1622214323@qq.com.

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