循环microRNA-4281对肝癌的诊断与预后评估研究

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(1.南华大学附属南华医院，湖南 衡阳，421000 ；2.南华大学医学院；3.邵阳学院医学部)

·临床医学·

循环microRNA-4281对肝癌的诊断与预后评估研究

胡甜1,2，李金成3，阳学风1，张楚红1，李赛1，吕秀1，贺莎1，严汉兴1，谭贻兮1，陈荣如1，文美玲1*，左建宏1,2*

(1.南华大学附属南华医院，湖南 衡阳，421000 ；2.南华大学医学院；3.邵阳学院医学部)

目的探讨循环miRNA-4281在肝癌患者血清中的表达情况及对诊断的临床意义。方法运用QRT-PCR技术分别检测45例肝癌患者(肝癌组)及正常人(对照组)血清中miRNA-4281的表达量。结果与对照组相比，肝癌患者血清标本中miRNA-4281的表达量明显高于正常人，且差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线下面积是0.805，microRNA-4281作为肝癌诊断的灵敏度为84.40%，特异度是73.30%。miRNA-4281的表达与AFP无明显相关性。Kaplan-Meier分析提示miRNA-4281表达水平高的患者具有较短的生存期限(P<0.05)。结论检测miRNA-4281有利于肝癌的诊断，可作为HCC 潜在的临床诊断标志物，同时其对于评估患者的预后具有重要作用。

肝癌； miRNA-4281； 诊断； 预后

原发性肝癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，其高居癌症相关死亡肿瘤的世界第三位，具有恶性程度高、转移率高、复发率高及生存率低的流行病学特点，严重危害人民生命健康，成为威胁人类公共卫生的巨大挑战[1]。由于肝癌的早期临床表现隐匿和缺乏有效的早期诊断，大部分患者诊断时都为晚期肝癌，常伴有远处转移或肝内转移，其预后差，生存期短。因此，早期发现和诊断对于及时采取有效的治疗手段，改善患者预后，延长生存期具有重要的临床意义[2]。循环microRNA(miRNA)是一类单链，内源性非编码小分子RNA[3]。研究表明miRNAs参与了疾病的发生发展、复发及转移,miRNA的表达紊乱是导致包括肝癌在内的一系列肿瘤形成的重要因素[4]。目前已有研究证明循环microRNA在肝癌的诊断、转移复发以及预后中都具有重要的作用[5-6]。例如研究表明miR-20a可以抑制Hep G2细胞(肝肿瘤细胞)的生长、侵袭以及转移，因此有望作为肝癌诊断和治疗的新分子靶点[7]。但对于miRNA-4281与肝癌的关系报道较少，因此，本文研究miRNA-4281在肝癌患者以及正常人血清中的表达情况，分析其与肝癌相关病理生理的关系，明确miRNA-4281在肝癌诊断和预后中的作用。

1 资料与方法

1.1实验对象45例肝癌患者组来自于南华大学附属南华医院及附属第一医院在2015年9月至2016年1月的肝癌患者。患者年龄为31～80岁，平均年龄为57.64岁。每例肝癌患者至少经过超声、CT 和组织病理学中的两种方法，并结合相关病史及血清AFP 水平而确诊。所有样本均在患者进行治疗前收集。对照组的45例正常人血清样本来自南华大学附属南华医院体检中心，年龄28～72岁，平均年龄45.22岁。所有参与研究者在实验前均签署了知情同意书，同时经过了南华大学伦理委员会的批准。肝癌患者组和健康对照组均取外周血2 mL，离心后取上层血清，放至-80 ℃环境中保存。

1.2实验材料所有实验耗材均购自湖南科泰公司，QIAzol Lysis Reagent 、miScript II RT Kit、miRNeasy Serum/Placma Kit 、Has_miR-4281、Has_miR-6087、 Has_miR-39特异性反转录引物及qPCR特异性扩增引物、miScipt SYBR Green PCR Kit均购自德国Qiagen公司。

1.3实验方法

1.3.1 总RNA的提取 取上层血清标本200ul，加入5倍量的QIAzol试剂并严格按照QIAzol Lysis Reagent试剂盒说明书上进行操作。

1.3.2 cDNA合成 取3uL上述步骤中提取的RNA做模板，参照miScript II RT Kit试剂盒上要求，分别加入以下试剂：4μL of 5x miScript HISpec Buffer,2 μL of 10x miScript Nucleics Mix,9μL of RNase-free water and 2μL of miScript Reverse Transcriptase Mix。反应体系共20μL，放至PCR逆转录仪中，设置反应条件为37 ℃ 60分钟，95 ℃ 5分钟，4 ℃ 30分钟。最后所得cDNA中加入200μL无酶水后可放至-20 ℃中长期保存。

1.3.3 QRT-PCR 反应在48孔板中分别加入5 μL of 2× QuantiTect SYBR Green PCR master Mix,1 μL of 10× miScript Universal Primer,1ul of 10× Has_miR-39 miScript Primer Assay or 1μL of Has_miR-miRNA-4281 miScript Primer Assay,2μL of RNase-free water 和 1 μL 上述cDNA。使用实时荧光定量PCR仪(illuminaEco 48)，反应分为两步，第一步是95 ℃ 15分钟预变性1个循环；然后进行第二步扩增40个循环(95 ℃15秒，55 ℃30秒，70 ℃30秒)。

本次实验使用2-△△CT法来进行比较，同时利用miR-39作为内参进行数据的标准化，测出miRNAs的相对表达量。同时为了进一步保证实验的准确性，每次实验均设置了三个重复孔，利用重复孔的平均值进行计算。

1.3.4 统计分析 数据用均数±标准差表示。采用了SPSS 18.0 统计软件进行分析。miRNA-4281的相对表达量miRNA-4281在肝癌患者及正常人中表达量水平的比较使用了t检验。miRNA-4281的表达量与肝癌患者临床特征各参数间的比较运用了单因素变量分析，以P<0.05表示为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miRNA-4281在肝癌患者及正常人血清中的表达水平miRNA-4281在肝癌患者血清中的相对表达量是11.87±2.44。正常人血清中miRNA-4281的相对表达量分别是8.38±2.11。结果提示miRNA-4281在肝癌患者血清中的表达量明显高于正常人，两者有统计学差异(P<0.05)(见图1)。通过绘制受试者工作曲线(ROC)(见图2)，当miRNA的相对表达量为10.86时，其Youden指数最大，此时miRNA-4281诊断肝癌的ROC曲线下面积是0.805，并且其灵敏度是84.40%，特异度是73.30%。上述结果提示检测miRNA-4281对于肝癌诊断具有重要的意义。

2.2 miRNA-4281与AFP的相关性分析通过计算Pearson相关系数，来分析miRNA-4281与AFP的之间相关性。分析结果得出miRNA-4281与AFP之间相关性r=0.15，P=0.9，说明miRNA-4281与AFP没有相关性，可作为肝癌的独立诊断标准.

2.3 miRNA-4281与肝癌患者临床病理特征的相关性分析不同性别、肿瘤大小、疾病分期、AFP水平、肝功能(转氨酶、总胆红素)、乙型肝炎表面抗原等临床特点中，miRNA-4281的表达量无明显差异(P>0.05)(见表1)。将实验中miRNA-4281的表达量按其平均数分为高、低两组。实验结果表明miRNA-4281表达量高的组别中，其病人的生存期相对较短，且高、低两组数据的差异同样具有统计学意义(P<0.05)(见图3)。

图1 microRNA-4281在正常人及肝癌患者血清中的表达情况

图2 microRNA-4281在肝癌患者血清诊断的ROC曲线

3 讨 论

众所周知，肝癌起病隐匿，早期临床症状不明显，同时由于现有诊断手段的局限，病人确诊时多为晚期。如果能够早期诊断，在肝癌只有单一肿块或肿块大小在2cm以内，早期进行根治性手术，患者的5年生存期将大大延长[8]。因此，需要一种行之有效的诊断方法来提高早期诊断率。目前临床上主要是通过血清AFP检测以及影像学检查等来进行肝癌的诊断，但是这些诊断手段仍存在一定的局限性，无法十分有效的进行肝癌的早期诊断[9]。与AFP不同的是，miRNAs 更早、更稳定的在体液或组织中表达，即使经过高温、极酸或极碱性条件下，血浆中miRNAs的含量变化不大，甚至是经过多次冻融循环，其同样能保持相对稳定[10]。越来越多的研究表明，miRNAs对于包括肝癌在内的许多疾病的发生、发展、增殖及转移等多个生物学过程都起到了一定的作用[3，11]。已有研究证明了miR-96可以作为肝癌诊断的新型标志物，同时其表达水平与肿瘤大小及分期有关[12]。Ruan T 等发现了miR186在肝癌患者中是低表达的，同时其可抑制肝癌细胞的增值、转移及侵袭[13]。另外研究发现miR-101可通过作用于血管内皮因子来抑制肝癌细胞的迁移和侵袭，这对于利用microRNA对肝癌进行靶向治疗提供了有利证据[14]。目前已有大量关于肝癌中循环microRNA的研究，也证明了其对于肝癌的诊断、转移以及预后的关系。但是目前关于miRNA-4281在肝癌中的表达情况并没有相关的研究报道。本研究通过高通量筛查选出在肝癌患者及正常人血清标本中表达水平具有明显差异的miRNA-4281。结果显示肝癌患者血清miRNA-4281的表达量较正常人明显升高(P<0.05)，同时ROC曲线分析得出miRNA-4281检测对于肝癌诊断的灵敏度和特异度均较高，并且其与AFP的表达水平无明显相关性，可做为肝癌的独立诊断标准[15]。本研究结果显示miRNA-4281的表达水平与患者的性别、肿瘤大小、疾病分期、肝功能情况以及存在过乙型肝炎病毒感染等无明显差异(P>0.05)，提示miRNA-4281可以用于肝癌的诊断，有可能作为一种新的肿瘤标志物。Kaplan-Meier生存曲线分析表明miRNA-4281表达水平高的患者倾向于有更短的生存期(P<0.05)。

表1 miRNA-4281的表达量与肝癌患者临床特征的相关性分析

图3 microRNA-4281表达水平高(黑线)的患者有较低的生存期，浅色线提示miRNA-4281表达低组具有较高的生存期，两组数据的差异有统计学意义

综上所述，本研究发现miR-4281在肝癌患者中明显升高，说明其可能在肝癌的发生、发展中发挥了重要作用，为肝癌的诊断和预后评判提供了新思路，是否能作为评估患者预后的潜在标志物还需进一步研究。

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StudyofcirculatingmicroRNA-4281fordiagnosisandprognosticvaluationinhepatocellularcarcinoma

HU Tian,LI Jiancheng,YANG Xuefeng,et al

(TheAffiliatedNanhuaHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo measure the expression of the circulating miRNA-4281 in the serum of patients with hepatocellular carcinoma (HCC),and to find out the clinical meaning in diagnosis.MethodsBlood samples from normal healthy (n=45) and HCC patients (n=45) were collected,respectively.Quantitative Real-time PCR was used to detect the expression level of miRNA-4281 in the two groups.ResultsThe expression of miRNA-4281 was significantly higher in the patients compared to that in the control (P<0.05).The area under receiver-operating characteristic curve was 0.805,with the sensitivities of 84.40% and the specificities of 73.30%.The expression level of miRNA-4281 and AFP had no correlation.Kaplan-Meier showed that the patients seemed to live a shorter time with the high expression of miRNA-4281(P<0.05).ConclusionDetecting miRNA-4281 may help to diagnose HCC.MiRNA-4281 may be a potential marker in the diagnosis and the prognosis.

hepatocellular carcinoma; miRNA-4281; diagnosis; prognosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.01.013

2016-06-18；

2016-12-29

国家自然科学基金(81272960)，湖南省科技厅重点项目(2013WK2010，2014SK2015)，人社部重点项目〔2016〕176号和天晴肝病研究基金(TQGB20140155).

*通讯作者，E-mail:632138414@qq.com.

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