ACLY在结肠癌组织中的表达及其临床意义

张金倩，陈洪

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.东南大学附属中大医院 消化内科，江苏 南京 210009)

ACLY在结肠癌组织中的表达及其临床意义

张金倩1，陈洪2

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.东南大学附属中大医院 消化内科，江苏 南京 210009)

目的探索ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)在结肠癌组织中的表达情况及其临床病理学意义，为结肠癌的诊治提供新思路。方法以50例结肠癌患者为研究对象，用免疫组织化学染色方法观察结肠癌患者的癌组织及对应的癌旁组织标本中ACLY的表达，并研究ACLY表达的临床病理学意义。结果在结肠癌组织中ACLY表达显著高于对应的癌旁组织(P=0)；ACLY高表达与结肠癌的浸润深度、淋巴结转移及TNM分期显著相关(P值分别为0、0.005及0.007)；与年龄、性别、肿瘤大小、组织分化程度无相关性(P>0.05)。结论ACLY在结肠腺癌组织中高表达,且与肿瘤转移相关；ACLY有望成为结肠癌诊治的一个新靶点。

结肠癌； ATP柠檬酸裂解酶； 免疫组织化学； 临床病理学； 相关性

1 对象与方法

1.1 研究对象

纳入2015年8月至2016年6月期间在东南大学附属中大医院手术后经病理学证实的50例结肠癌患者为研究对象。取其结肠癌组织标本，在4 ℃下以10%福尔马林固定24 h，PBS冲洗，进行石蜡包埋。结肠癌标本取自肿瘤组织非坏死区，相应癌旁组织取自距离癌组织边缘5 cm以上的区域。结合临床资料对结肠腺癌标本进行TNM分期,并行免疫组织化学染色[7]。人抗兔单克隆ATP柠檬酸裂解酶为英国Abcam公司产品(ab207504)，工作浓度为1∶150(用抗体稀释液稀释)。

1.2 入组与排除标准

入组标准:(1)因结肠癌首次就诊；(2)病例资料完整；(3)未经过特殊治疗。排除标准:(1)非首次就诊的病例；(2)有其他结肠疾病，例如炎症性肠病、结肠结核等；(3)结肠多部位病变；(4)术前行新辅助放化疗者；(5)患有其他部位恶性肿瘤。

1.3 组织免疫化学操作步骤

将石蜡切片，烤片，梯度脱蜡，自来水冲洗后抗原微波修复，PBS液浸泡。每张片子加50 μl稀释好的ACLY抗体(一抗)，置冰箱4 ℃孵育过夜， PBS冲洗；每张片加50 μl稀释好的二抗，室温孵育25 min，PBS冲洗，DAB显色，显微镜下观察染色的深浅，中止染色。苏木素复染，梯度酒精脱水，吹风机吹干，中性树胶封片后在镜下观察。

1.4 结果判断

实验结果判定以正常山羊血清为阴性对照,空白对照为磷酸盐缓冲液。用已知阳性组织作为阳性对照,应用免疫组化法测定ACLY相对表达，出现棕黄色颗粒为阳性。对ACLY染色阳性部位采用免疫组化半定量分析方法进行阳性细胞计数。参照Fromowitz[8]方法，在200倍显微镜下观察评分:阳性细胞数<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别记为0、1、2、3、4分；阳性强度分别以0、1、2、3分对应于无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色。两项记分相加[7]，总分<4分为低表达，≥4分为高表达。在双盲法下由两名病理医师分别对每张切片进行计数，如果结果相差大于10%则重新计数[9]。

1.5 观察指标

记录患者姓名、年龄、术前诊治经过、手术时间、病理号码、病理资料(分期分型均参照WHO分类方法进行)、ACLY水平等。

1.6 统计学处理

采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析，结果采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ACLY在结肠癌及癌旁正常组织中的表达

免疫组化结果显示，ACLY主要表达于细胞质中，在细胞核中较少表达。ACLY在癌组织中高表达，而在癌旁组织中呈低表达或不表达(图1)。ACLY在结肠癌组织的表达水平显著高于癌旁组织(P=0)，见表1。

A.ACLY在癌旁正常组织中低表达；B.在TNM分期Ⅱ期中较高表达；C、D.在TNM分期Ⅲ、Ⅳ期结肠癌组织中高表达

图1结肠癌组织及癌旁组织中ACLY的表达二步法染色×200

表1 ACLY在结肠癌组织及癌旁正常组织中的表达情况例

2.2 ACLY在结肠癌中表达的临床病理学意义

对结肠癌组织中ACLY的表达情况与临床病理学参数进行评估结果发现，ACLY的高表达与结肠癌浸润深度、淋巴结转移及TNM分期显著相关(P值分别为0、0.005及0.007)，但与年龄、性别、肿瘤大小、组织分化程度之间无显著相关(P>0.05)，见表2。

表2结肠癌组织中ACLY表达情况与患者临床病理资料的比较

临床指标nACLY高表达低表达p值性别1 男25205 女25205年龄/岁0．765 ≤6017143 >6033267肿瘤大小/cm0．619 ≤639327 >61183分化程度0．139 高+中382810 低660淋巴结转移0．005 有25241 无25169侵袭深度0 T1+T2615 T3+T444395TNM分期0．007 Ⅰ+Ⅱ26179 Ⅲ+Ⅳ24231

3 讨 论

本研究通过免疫组化方法检测并比较了50例结肠癌组织及相应的癌旁组织中ACLY表达情况，结果表明，ACLY在结肠癌组织中表达上调(P<0.05)。ACLY主要是细胞质酶，集中存在于内质网，但在细胞核中也发现过ACLY的存在。本研究也显示，ACLY主要位于细胞质中，与ACLY主要是胞质酶的这一结论吻合。本研究从组织学水平发现ACLY在结肠癌组织中表达上调。近年Christensen等[18]从细胞水平研究发现，抑制体外细胞株中ACLY能够诱导结肠癌细胞凋亡，研究表明，snoRNA宿主基因16 (SNHG16)在结肠癌患者中表达上调，SNHG16影响脂质代谢相关基因。在临床实践中可以观察到SNHG16及肿瘤脂质代谢相关基因之间的关系，也可以观察到癌组织中异常的从头脂质合成过程。敲除SNHG16可以抑制脂质代谢相关通路，如ACLY相关代谢途径。

大量的研究已经表明，远处淋巴结转移、癌组织浸润是结肠癌临床病理分期最重要的自变量，结肠癌进展需要一个精确的阶段评估。TMN分期是影响结肠癌进展及预后最重要的变量。在本研究中，淋巴结转移、侵袭深度和TMN分期被确定为独立的ACLY表达相关变量，故可以推测ACLY表达水平与结肠癌进展相关，检测结肠癌组织中ACLY的表达情况可能为结肠癌临床病理分期提供新的依据。

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