岩藻糖基转移酶Ⅶ通过sLeX糖基化诱导肺癌A549细胞上皮间质转化的研究

梁津逍 王纪 文蔡磊 杨迅

●基础研究

岩藻糖基转移酶Ⅶ通过sLeX糖基化诱导肺癌A549细胞上皮间质转化的研究

梁津逍 王纪 文蔡磊 杨迅

目的研究岩藻糖基转移酶Ⅶ（FUT7）对肺癌A549细胞上皮间质转化（EMT）的影响。方法采用质粒转染法对A549细胞中FUT7基因进行过表达；划痕实验检测细胞侵袭能力；Western blot法检测唾液酸化的路易斯寡糖-X抗原（sLeX）糖抗原以及EMT相关蛋白表达水平。结果转染FUT7过表达质粒后A549细胞中FUT7蛋白的表达明显增强（P＜0.01），与空白质粒转染组相比，sLeX抗原表达增高（P＜0.05），细胞侵袭能力增强。FUT7过表达质粒转染组与空白质粒转染组相比，E-cadherin蛋白表达减少，N-cadherin、Vimentin蛋白表达均增加（均P＜0.01），利用sLeX抗体封闭细胞表面sLeX抗原后FUT7过表达细胞E-cadherin蛋白表达增加（P＜0.05），而N-cadherin、Vimentin蛋白表达减少（P＜0.05或0.01）。结论FUT7可通过sLeX糖基化作用诱导肺癌A549细胞发生EMT，导致细胞侵袭转移能力增强。

岩藻糖基转移酶Ⅶ唾液酸化路易斯寡糖-X上皮间质转化肺癌

岩藻糖基转移酶是糖基转移酶家族的一员，可将L-岩藻糖从GDP-岩藻糖中转移至糖链末端N-乙酰氨基乳糖残基的N-乙酰氨基葡萄糖上，并以α岩藻糖键相连接[1]。其中，岩藻糖基转移酶Ⅶ（FUT7）具有高底物专一性，只能合成唾液酸化的路易斯寡糖-X抗原（sialyl Lewis-X，sLeX）[2]。Ogawa等[3]首先发现FUT7在肺癌细胞中的表达要高于正常细胞，与sLeX有密切联系，且与肺癌患者的预后显著相关。近来研究表明，sLeX是细胞黏附分子E-selectin的配基，两者有高度亲和力。血循环中的癌细胞在转移之前，必须先黏附于血管内皮上，而E-selectin表达于内皮细胞，导致癌细胞与血管内皮细胞黏附，引起血行转移[4]。上皮间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）与肿瘤的侵袭转移具有密切联系，是肿瘤的恶性生物学行为之一。目前FUT7与EMT之间的关系尚不明确，本研究通过体外实验探讨FUT7对肺癌细胞EMT的影响，为临床应用提供一定的实验依据，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂RPMI-1640培养基（美国Gibco公司），FBS（美国Gibco公司），FUT7过表达质粒及空白质粒（中国吉玛基因公司），FUT7抗体（美国Sigma公司），sLeX抗体（美国默克密理博公司），E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗体（美国Proteintech公司），凝胶成像分析系统（美国Bio-Red公司），倒置显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人肺癌A549细胞由中科院上海细胞库提供，于10%FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的RPMI1640培养基中培养。于37℃、5%CO2、90%湿度温箱中培养，取对数生长期细胞进行实验，各实验均重复3次。

1.2.2 A549细胞的质粒转染取对数生长期的细胞，以密度为5×104/ml铺于6孔板上，分为FUT7过表达质粒转染组和空白质粒转染组。培养细胞至80%融合，换无血清无双抗培养基培养6h。取2μg FUT7过表达质粒/空白质粒加入100μl双无培养基，混匀。2.5μl脂质体加入100μl双无培养基，室温静置5min后与含质粒的培养基混匀，静置20min。将该200μl混合液加入800μl双无培养基中，并分别加入相应孔内，37℃、5%CO2、90%湿度条件下培养6h。各孔换液后加入含血清培养基，继续于37℃、5%CO2、90%湿度条件下培养48h后进行实验。

1.2.3 Western blot法检测蛋白表达水平检测FUT7质粒转染后FUT7蛋白和sLeX抗原表达分为FUT7过表达质粒转染组和空白质粒转染组。检测FUT7表达对A549细胞EMT的影响分为空白质粒转染组、FUT7过表达质粒转染组和FUT7过表达质粒转染＋sLeX抗原封闭组。FUT7过表达质粒转染＋sLeX抗原封闭组在FUT7质粒转染6h后换液时向培养基中加入sLeX抗体（1∶1 000稀释），以封闭sLeX抗原。各组培养皿中的细胞生长至90%时，去掉细胞培养液，PBS洗3次。加入适量RIPA缓冲液裂解，冰上放置10min，10 000r/min离心5min，取上清液。BCA法检测蛋白浓度，取50μg总蛋白进行电泳。SDS-PAGE凝胶分离胶和浓缩胶浓度为12%和5%。浓缩胶80V，分离胶120V进行电泳，电泳结束后，湿转法将蛋白转移至孔径0.2μm的PVDF膜上，5%进口奶粉封闭1h，加入相应抗体孵育过夜。TBST洗涤，滴加相应二抗，室温孵育1h，ECL显色5min，凝胶成像仪曝光获得相应条带。

1.2.4 划痕实验检测细胞侵袭能力6孔板背面沿直尺均匀得划横线，每隔0.5～1cm一道，横穿过孔，每孔至少5条线。分为FUT7过表达质粒转染组和空白质粒转染组，各组加入约5×105个细胞，培养箱培养过夜。次日用枪头沿着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。放入培养箱中培养，按0、12、24h取样，拍照，观察周边细胞是否生长至划痕区，以进入划痕区的迁移细胞数判断细胞侵袭能力的强弱。

1.3 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件，计量资料组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染质粒后A549细胞中FUT7蛋白及sLeX抗原的表达见图1。

图1 转染FUT7过表达质粒后A549细胞中FUT7蛋白和sLeX抗原表达的变化（与空白质粒转染组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

由图1可见，与空白质粒转染组相比，转染FUT7过表达质粒后A549细胞中FUT7蛋白及sLeX抗原表达明显增强，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。

2.2 转染FUT7过表达质粒后A549细胞侵袭能力的变化见图2。

由图2可见，与空白质粒转染组相比，转染FUT7过表达质粒后A549细胞进入划痕区的迁移细胞数明显增多，其侵袭能力明显增强。

2.3 转染FUT7过表达质粒以及sLeX抗体封闭抗原对A549细胞EMT的影响见图3。

图2 转染FUT7过表达质粒后A549细胞侵袭能力的变化

图3 转染FUT7过表达质粒以及sLeX抗体封闭抗原对A549细胞EMT的影响（A：空白质粒转染组，B：FUT7过表达质粒转染组，C：FUT7过表达质粒转染+sLeX抗体封闭组；与FUT7过表达质粒转染组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

由图3可见，与空白质粒转染组相比，FUT7过表达质粒转染组A549细胞E-cadherin蛋白表达降低，N-cadherin、Vimentin蛋白表达增加，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。而利用sLeX抗体封闭细胞表面sLeX抗原后FUT7过表达细胞E-cadherin蛋白表达增加，N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。

3 讨论

肺癌是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。2017年全世界范围内男女肺癌的发病率均居所有癌症第2位，其病死率居首位[5]。虽然肺癌的诊疗手段在不断改进与发展，但因其起病隐匿，较早出现淋巴结及血行转移，导致患者失去了最佳治疗时机，致使肺癌的病死率仍然居高不下。因此，深入探索肺癌转移相关分子生物学机制对于寻找有效治疗方法，改善患者预后至关重要。

近年来，学者们发现蛋白的翻译后修饰在肿瘤的发生、发展中扮演着不可或缺的角色[6]。作为一种重要的翻译后修饰，糖基化参与蛋白质肽链的折叠、聚合、成熟和运输[7]，且肿瘤细胞中某些糖蛋白的糖基化修饰会随着肿瘤的发生、发展而改变，导致其配体结合、信号传导、分子黏附等生物学功能异常，引起肿瘤细胞生长、凋亡、侵袭转移能力发生变化[8]。因此，肿瘤的糖生物学研究也逐渐成为近来肿瘤研究领域的热点。

岩藻糖是哺乳动物寡糖合成系统中的10种单糖之一，其糖基化是糖蛋白寡糖修饰中最常见的修饰方式。研究表明岩藻糖可修饰ABO血型系统的H抗原、Lewis抗原，以及多条重要的信号通路，有报道称在肿瘤细胞中岩藻糖基化水平存在异常[9]。FUT7是岩藻糖基转移酶家族的一员，与其他成员相比，FUT7具有高底物专一性，仅合成sLeX抗原[2]。因此，FUT7也成为研究单个糖基功能的良好工具。本研究对肺癌A549细胞进行质粒转染以过表达FUT7基因，发现sLeX糖抗原的表达也随之显著增加，这也进一步证实了FUT7表达可合成sLeX。Ma等[2]证实FUT7可以通过合成sLeX导致急性髓细胞白血病细胞多药耐药。Li等[10]发现FUT7可以通过糖基化CD24增强结肠癌细胞转移能力。FUT7还可调控紫外线和维甲酸诱导的肝癌细胞凋亡敏感性[11]。以上结果表明FUT7可调控肿瘤细胞的凋亡、转移、多药耐药等恶性生物学行为，在肿瘤的发生、发展过程中起到重要作用。本研究通过划痕实验发现FUT7过表达后A549细胞侵袭能力增强，进一步证明FUT7与肺癌侵袭转移密切相关。

sLeX抗原是表达在胚胎组织及肿瘤细胞表面糖脂和糖蛋白上的含有寡聚糖的一种碳水化合物抗原，其最小组成单位是三糖，即半乳糖（Gal）、N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）和岩藻糖（Fuc），由于Gal外侧接以α2，3唾液酸（SA）而成为唾液酸化的Lewis抗原，这种末端唾液酸化修饰是肿瘤实验模型N-糖基化异常的重要特征[12]。sLeX作为选择素核心识别表位与肿瘤转移及不良预后具有紧密联系[13]，前期研究中我们已通过Meta分析对其进行进一步验证[14]。研究表明sLeX是细胞黏附分子E-selectin的配基，其不但与癌细胞和血管内皮细胞之间的黏附相关[3]，还被证明与肿瘤微环境中血管生成存在密切联系[15]。基于上述研究结果，本文拟通过研究FUT7进一步探索sLeX在肺癌中的具体分子生物学机制。

EMT是指细胞从有极性的不能移动的上皮细胞转化为间质细胞，导致细胞的移动能力增加，其在肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用[16]。肿瘤细胞中TGF-β、Wnt、Notch信号通路异常，导致EMT相关蛋白如snail、ZEB1/2、E-cadherin、N-cadherin、Twist以及Vimentin表达异常，引起细胞发生EMT[16]。近来研究发现，糖基化与肿瘤EMT的发生也具有一定联系。Wang等[17]已证实岩藻糖基转移酶Ⅳ（FUT4）通过合成LeY抗原促进Ezrin磷酸化并诱导肺腺癌发生EMT；Mo等[18]证实N-乙酰葡萄糖基转移酶Ⅲ（GnT-Ⅲ）可通过Smad3和ERK信号通路调控肝癌细胞EMT。而FUT7以及sLeX与EMT之间的关系尚不明确。本研究发现FUT7过表达的肺癌细胞中N-cadherin以及Vimentin蛋白表达增高，而E-cadherin蛋白表达降低，这说明FUT7过表达可导致肺癌细胞EMT水平提高。本研究利用抗体封闭法沉默sLeX的表达，发现sLeX抗体封闭组EMT水平明显减少，说明FUT7通过促进sLeX寡糖抗原的表达诱导肺癌细胞发生EMT。

综上所述，FUT7在体外实验中可通过sLeX糖基化作用诱导肺癌A549细胞发生EMT，导致细胞侵袭转移能力增强。然而有关其具体相关的分子生物学机制，还有待于进一步深入研究。

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Fucosyltrans ferase VII induces epithelial-mesenchymal transition of A549 cells via sLeX synthesis

LIANG Jinxiao,WANG Jiwen,CAI Lei,et al.
Department of Thoracic Surgery,Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou 310022,China

ObjectiveTo investigate the effect of fucosyltransferaseVII(FUT7)gene overexpression on epithelialmesenchymal transition(EMT)in lung cancer A549 cells.MethodsA549 cells were transfected with FUT7 cDNA plasmid,and the migration ability was determined by wound healing assay.The expression of sialyl Lewis-X(sLeX)antigen and EMT related proteins were determined by Western Blot.ResultsThe expression of FUT7 protein was significantly augmented in A549 cells after transfected with FUT7 plasmid(P＜0.01).Compared with blank plasmid,the expression of sLeX antigen was significantly increased(P＜0.05),and the migration ability was enhanced in A549 cells transfected with FUT7 plasmid;the expression of E-cadherin protein was decreased,the expression of N-cadherin and Vimentin protein were increased in A549 cells after transfected with FUT7 plasmid(all P＜0.01).While the expression of E-cadherin protein(P＜0.05)was increased,the expression of N-cadherin(P＜0.05)and Vimentin(P＜0.01)were decreased after blockage of sLeX antigen in FUT7 overexpression A549 cells.Conclusion FUT7 overexpression promotes the EMT level and the migration ability of A549 cells via unregulation of sLeX antigen expression.

Fucosyltransferase ⅦSialyl Lewis-XEpithelial-mesenchymal transition Lung cancer

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2017-2591

310022杭州，浙江省肿瘤医院胸部肿瘤外科

杨迅，E-mail：zlyy633@qq.com

2017-10-27）

（本文编辑：马雯娜）