巢湖蓝藻藻蓝蛋白稳定性的实验研究

鲁轶男,张发宇,胡淑恒,汪家权

(合肥工业大学 资源与环境工程学院,安徽 合肥 230009)

巢湖蓝藻藻蓝蛋白稳定性的实验研究

鲁轶男,张发宇,胡淑恒,汪家权

(合肥工业大学 资源与环境工程学院,安徽 合肥 230009)

文章以巢湖新鲜蓝藻藻泥为实验原料,冻融3次后提取获得藻蓝蛋白粗提液,经过两步盐析纯化得到藻蓝蛋白溶液。实验重点研究了温度、pH值、冻融次数及添加剂等因素对两步盐析后藻蓝蛋白溶液稳定性的影响,确定了藻蓝蛋白溶液保存的较优条件。结果表明:低温、pH值为中性条件有利于藻蓝蛋白溶液的保存;糖类、防腐剂、抗氧化剂、金属离子的添加也会影响藻蓝蛋白稳定性。

两步盐析;纯化;藻蓝蛋白

水体富营养化是水体中氮、磷、钾含量过高导致藻类突然性过度增殖的一种自然现象,通常水的颜色呈现绿色或蓝色,水体有机物积蓄,破坏了水体的生态平衡[1]。近年来,巢湖水体富营养化日益加重,危害性越来越大。打捞上来的蓝藻处理不当会造成严重的环境污染。

目前国内外关于水华蓝藻资源化研究主要集中在厌氧发酵、好氧堆肥,产品附加值低,经济效益不高。近年来,从水华蓝藻中提取高纯度的藻蓝蛋白成为巢湖蓝藻高附加值资源化的重要方向。研究表明,高纯度藻蓝蛋白具有良好的功效,如抗炎性[2]、抗癌性[3]、抗过敏性[4]、抗氧化性[5-6]、免疫荧光性[7-8]等。并且藻蓝蛋白是一种色素蛋白,具有和普通蛋白质相同的性质,溶于水,不溶于醇和油脂,对热、光、酸不稳定,在弱酸性和中性条件下较为稳定(pH值在4.5～8.0之间),酸性条件下(pH=4.2)发生沉淀,强碱条件下则脱色。因此针对提取纯化后的较高纯度的藻蓝蛋白,进行稳定性的相关实验研究,掌握保存纯化后的藻蓝蛋白的条件就显得尤为重要。

目前国内外有关藻蓝蛋白稳定性的实验研究开始得到重视[9-16]。本文主要通过冻融破壁方法获取藻蓝蛋白粗提液,再通过两步盐析法纯化得到藻蓝蛋白溶液。重点针对两步盐析后的藻蓝蛋白溶液,综合考虑温度、酸碱度、冻融次数、添加剂等因素对藻蓝蛋白稳定性的影响,得到藻蓝蛋白较适宜的保存条件,为藻蓝蛋白的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用蓝藻取自西湖区水华表层20 cm水体处,含水量约96.2%,采集日期为2014年8月4日,室外气温37～38 ℃,采集后置于冰箱中冷冻保存,冰箱温度为-18 ℃。

常用试剂:(NH4)2SO4、HCl、NaOH、浓度为0.002 5 mol/L的磷酸缓冲溶液、葡萄糖、蔗糖、苯甲酸钠、叠氮化钠、柠檬酸、抗坏血酸、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、硫酸铜。

1.2 仪器与设备

所用仪器设备有:紫外-可见分光光度仪,UV/VIS-1950型(北京普析通用公司);低温高速离心机,KDC-160HR型(安徽中科中佳仪器公司);冷柜,BC/BD-718DTF型(天长市天一电器有限公司);恒温搅拌器,85-2A型(江苏金城国胜仪器厂);数显酸度计,PHS-25型(中国杭州雷磁分析仪器厂);水浴锅,HH-2型(上海基玮试剂仪器设备有限公司)。

1.3 分析方法

藻蓝蛋白在620 nm处有最大特征吸收峰,并在280 nm处有吸收峰。藻蓝蛋白的纯度(P)参考文献[17]推荐的公式,即

P=A620/A280,

其中,A280、A620分别为藻蓝蛋白在280、620 nm处的吸光度。

1.4 制备两步盐析后藻蓝蛋白溶液

反复冻融冷冻保存的新鲜蓝藻藻泥3次,取解冻后的蓝藻破壁液在4 ℃、8 000 r/min的离心机中离心20 min,上清液用4层普通纱布过滤,得到藻蓝蛋白粗提液。

根据文献[18-19]的实验研究,向藻蓝蛋白粗提液中投加1.0 mol/L的硫酸铵溶液进行一步盐析,4 ℃离心后去除底层沉淀。继续投加硫酸铵进行两步盐析,硫酸铵的浓度增加至2 mol/L,4 ℃下离心20 min后保留沉淀,用磷酸缓冲溶液(0.002 5 mol/L)溶解获得藻蓝蛋白溶液。

1.5 藻蓝蛋白稳定性单因素试验

1.5.1 温度对藻蓝蛋白稳定性的影响

取等体积的藻蓝蛋白溶液,分别置于-18、4、35、50 ℃温度下,每天测定1次藻蓝蛋白纯度,研究温度对藻蓝蛋白稳定性的影响。

1.5.2 pH值对藻蓝蛋白稳定性的影响

调节藻蓝蛋白溶液的pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10,置于冷藏条件(4 ℃)下,测定藻蓝蛋白纯度,研究酸碱度对藻蓝蛋白稳定性的影响。

1.5.3 反复冻融对藻蓝蛋白稳定性的影响

取适量藻蓝蛋白溶液,置于冷冻(-18 ℃)条件下,反复冻融解冻后测定藻蓝蛋白的纯度,研究反复冻融对藻蓝蛋白稳定性的影响。

1.5.4 糖类对藻蓝蛋白稳定性的影响

称取不同质量的蔗糖、葡萄糖,溶于水中,调节蔗糖、葡萄糖的质量分数分别为0、1%、2%、4%、8%,将等体积藻蓝蛋白溶液置于上述溶液中,冷藏保存,隔天测定藻蓝蛋白纯度,研究糖类对藻蓝蛋白稳定性的影响。

1.5.5 防腐剂对藻蓝蛋白稳定性的影响

称取不同质量的叠氮化钠、苯甲酸钠,溶于水中,调节叠氮化钠、苯甲酸钠的质量分数分别为0、2%、4%、6%、8%、10%,将等体积藻蓝蛋白溶液置于上述溶液中,冷藏条件下隔天测定藻蓝蛋白纯度,研究防腐剂对藻蓝蛋白稳定性的影响。

1.5.6 抗氧化剂对藻蓝蛋白稳定性的影响

配制柠檬酸和抗坏血酸溶液,调节柠檬酸和抗坏血酸的质量分数分别为0、2%、4%、6%、8%、10%,取等体积藻蓝蛋白溶液置于上述溶液中,24 h后测定藻蓝蛋白的纯度,研究抗氧化剂对藻蓝蛋白稳定性的影响。

1.5.7 金属离子对藻蓝蛋白稳定性的影响

取不同质量氯化钠、氯化钾、硫酸铜、氯化钙,溶于水中,调节氯化钠、氯化钾、硫酸铜、氯化钙的质量分数分别为0、2%、4%、6%、8%、10%,取等体积藻蓝蛋白溶液置于上述溶液中,冷藏保存后测定藻蓝蛋白纯度,研究金属离子对藻蓝蛋白稳定性的影响。

2 结果与分析

2.1 温度对藻蓝蛋白稳定性的影响

实验结果如图1所示。

由图1可知,4种温度下藻蓝蛋白纯度均呈下降的趋势,温度越高,纯度下降越明显。其中,温度为-18 ℃时藻蓝蛋白较为稳定,1周后,藻蓝蛋白纯度基本不变;而温度为50 ℃时,藻蓝蛋白稳定性最差,纯度随时间急剧下降,1周后,蛋白纯度基本降为0。根据上述分析,藻蓝蛋白应保存在较低温度环境下,-18 ℃以下温度最为适宜。

图1 温度对藻蓝蛋白稳定性的影响

2.2 酸碱度对藻蓝蛋白稳定性的影响

实验结果如图2所示。

图2 酸碱度对藻蓝蛋白稳定性的影响

由图2可知,过酸(pH值为2和3)或过碱(pH=10)条件下,藻蓝蛋白溶液瞬间变性,纯度降低,溶液颜色由蓝色变为灰绿色;在pH值为5～8之间,藻蓝蛋白溶液有较好的稳定性,溶液仍为鲜亮的蓝色。

将pH值为5～8的藻蓝蛋白溶液置于冷藏条件(4 ℃)下,待到1周后,pH值为6或7时,藻蓝蛋白稳定性较高,其纯度下降率分别为5%和6%,纯度随时间变化不明显,藻蓝蛋白;pH值为5或8时,藻蓝蛋白纯度较低,随时间下降明显。根据上述分析可知,中性偏酸性条件有利于藻蓝蛋白保存。

2.3 反复冻融对藻蓝蛋白稳定性的影响

实验结果如图3所示。

图3 反复冻融次数对藻蓝蛋白稳定性的影响

由图3可知,冻融次数越多,藻蓝蛋白纯度越小。冻融10次后,藻蓝蛋白纯度下降率为65%。因此,应避免反复冻融藻蓝蛋白。

2.4 糖类对藻蓝蛋白稳定性的影响

不同质量分数葡萄糖、蔗糖溶液对藻蓝蛋白稳定性的影响分别如图4、图5所示。

图4 不同质量分数葡萄糖溶液的影响

图5 不同质量分数蔗糖溶液的影响

由图4和图5可知,藻蓝蛋白溶液在葡萄糖和蔗糖这2种糖类的4个不同质量分数下,4 ℃放置1周,较之对照组,都能保持良好的稳定性。糖类质量分数为4%时,对蛋白的保护效果最好,溶液仍然呈鲜亮的蓝色,而对照组,纯度降低明显,藻蓝蛋白的颜色逐渐变淡。不同质量分数的葡萄糖和蔗糖溶液对藻蓝蛋白的保护性不同,按保护程度从大到小对其质量分数排序依次为4%、2%、1%、8%,说明质量分数过高或过低都会降低糖类对蛋白的保护性。

2.5 防腐剂对藻蓝蛋白稳定性的影响

不同质量分数叠氮化钠、苯甲酸钠溶液对藻蓝蛋白稳定性的影响分别如图6、图7所示。

图6 不同质量分数叠氮化钠溶液的影响

图7 不同质量分数苯甲酸钠溶液的影响

由图6可知,藻蓝蛋白溶液在叠氮化钠的4个质量分数下,4 ℃放置1周,较之对照组,均能保持良好的稳定性。其中,质量分数为1%的叠氮化钠溶液对藻蓝蛋白的保护性最好;质量分数为8%的叠氮化钠溶液对藻蓝蛋白的保护性最差。不同质量分数的叠氮化钠溶液对藻蓝蛋白的保护性不同,按保护程度从大到小对其质量分数排序依次为1%、2%、4%、8%,说明其质量分数越低,对藻蓝蛋白溶液保护性越好。目测颜色变化,对照组溶液颜色逐渐变浅,但在其他各种质量分数的叠氮化钠溶液中藻蓝蛋白颜色也较浅。由此可得到,低质量分数的叠氮化钠溶液对藻蓝蛋白溶液都有保护作用,但护色效果不佳。

由图7可知,不同质量分数苯甲酸钠的添加均严重破坏藻蓝蛋白的稳定性,导致藻蓝蛋白变性,蛋白质沉淀现象明显。1 h后,藻蓝蛋白的纯度下降率为95%,由此可得,苯甲酸钠不可作为藻蓝蛋白溶液的防腐剂。

2.6 抗氧化剂对藻蓝蛋白稳定性的影响

实验结果如图8所示。

图8 不同质量分数柠檬酸、抗坏血酸的影响

从图8可知,不同质量分数的柠檬酸和抗坏血酸的添加均导致藻蓝蛋白严重变性,蛋白质沉淀现象明显。1 h后,藻蓝蛋白纯度下降率分别为80%和95%。因此,藻蓝蛋白的保存应避免与柠檬酸或抗坏血酸接触。

2.7 金属离子对藻蓝蛋白稳定性的影响

不同质量分数Na+、K+、Cu2+、Ca2+对藻蓝蛋白稳定性的影响分别如图9～图11所示。

图9 不同质量分数Na+对藻蓝蛋白稳定性的影响

图10 不同质量分数K+对藻蓝蛋白稳定性的影响

图11 不同质量分数Cu2+、Ca2+对藻蓝蛋白稳定性的影响

由图9可知,藻蓝蛋白溶液在质量分数为4%～10%的Na+溶液中,4 ℃放置1周,较之对照组,均能保持良好的稳定性;而质量分数为2 %的Na+溶液不利于藻蓝蛋白溶液的保存,纯度明显低于对照组。其中质量分数为4%～10%的Na+溶液对藻蓝蛋白溶液的保护性不同,按保护程度从大到小对质量分数排序依次为8%、10%、6%、4%,即离子质量分数越大,溶液稳定性越高。由此可得到,Na+溶液有利于藻蓝蛋白溶液的保存,溶液质量分数为8%时最为适宜。

由图10可知,藻蓝蛋白溶液在K+的5个质量分数下,1～5 d内,藻蓝蛋白纯度均低于对照组,第6天后,纯度有所上升,高于对照组。其中质量分数2%的K+使蛋白质纯度下降趋势最为明显,K+质量分数在4%～10%间,虽然质量分数有差别,但对藻蓝蛋白稳定性影响不明显。综合考虑可得到,K+溶液不适用于藻蓝蛋白溶液的保存。

由图11可知,不同质量分数的Cu2+和Ca2+的添加均严重破坏了藻蓝蛋白的稳定性,藻蓝蛋白的纯度随时间下降明显,24 h后,蛋白质有明显的沉淀现象,藻蓝蛋白纯度下降率分别为66%和94%。根据上述分析可得到,藻蓝蛋白溶液的保存应避免接触Cu2+和Ca2+。

3 结 论

在巢湖蓝藻藻蓝蛋白稳定性的实验研究中,本文研究了温度、冻融次数、酸碱度及糖类、氧化剂、防腐剂、金属离子的添加对其稳定性的影响。主要结论有:

(1) 藻蓝蛋白不耐高温,4 ℃以下有利于藻蓝蛋白的保存;中性条件下有利于藻蓝蛋白的保存;反复冻融会降低藻蓝蛋白的纯度。

(2) 抗氧化剂会迅速与蛋白质发生化学反应,不利于藻蓝蛋白溶液的保存。

(3) 不同质量分数的蔗糖与葡萄糖均能有效提高蛋白质的稳定性,糖的保护作用可能是因为糖的羟基与蛋白质形成氢键取代水,保证蛋白质的稳定性,溶液中它们易结合水分子发生水合作用,增加溶液黏性,减缓晶核生长,从而保护藻蓝蛋白[20]。

(4) 叠氮化钠在一定程度上能有效维持藻蓝蛋白的稳定性,而苯甲酸钠不适合作为藻蓝蛋白的防腐剂。

(5) 金属离子会影响藻蓝蛋白的稳定性,不同质量分数的Na+溶液对藻蓝蛋白溶液稳定性影响不同,较高质量分数的Na+溶液有利于藻蓝蛋白溶液的保存,其中质量分数8%最为适宜;K+离子对藻蓝蛋白稳定性的影响不大;Cu2+和Ca2+会导致藻蓝蛋白变性,出现蛋白质沉淀现象,造成这种现象的发生是由于金属离子与蛋白质发生发应,破坏蛋白质的结构,使蛋白质交联、聚集,从而形成沉淀[21]。

(6) 实验过程中不同批次的藻类,不同纯度的藻蓝蛋白之间稳定性存在差异,需要进一步研究。藻蓝蛋白溶液稳定性研究操作简单、可行性强,符合经济环保的科学理念,为藻蓝蛋白的保存及后期的实验研究提供了科学依据。

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ExperimentalstudyofthestabilityofphycocyaninfrombluealgaeinChaohuLake

LU Yinan,ZHANG Fayu,HU Shuheng,WANG Jiaquan

(School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The crude extracts of phycocyanin were obtained by three times freeze-thaw for fresh blue algae from Chaohu Lake. Extraction and purification of phycocyanin were performed by two-step salting-out. The effect of the temperature, pH value, number of freeze-thaw and additive on the stability of phycocyanin solution after two-step salting-out was studied, and the best condition to preserve the phycocyanin solution was determined. The results show that low temperature and neutral conditions are conducive to the preservation of the phycocyanin solution, and the addition of sugar, preservatives, antioxidants and metal ions affects the stability of phycocyanin.

two-step salting-out; purification; phycocyanin

2016-04-18；

2016-05-16

国家“十二五”科技重大专项资助项目(2012ZX07103-004)

鲁轶男(1991-),女,安徽桐城人,合肥工业大学硕士生;

张发宇(1983-),男,安徽安庆人,博士，合肥工业大学讲师,通讯作者,E-mail:13655551436@139.com;

汪家权(1957-),男,安徽太湖人,博士，合肥工业大学教授,博士生导师.

10.3969/j.issn.1003-5060.2017.11.024

TQ464.7

A

1003-5060(2017)11-1557-06

(责任编辑 张淑艳)