白藜芦醇对大鼠血液高凝态的抑制作用及其 与NF-κB表达的关系

王立文，沈晓洁*，吴 倩

(1.无锡卫生高等职业技术学校护理系，江苏 无锡 214028； 2.中国药科大学药学院药理系，南京 210009)

白藜芦醇对大鼠血液高凝态的抑制作用及其 与NF-κB表达的关系

王立文1，沈晓洁1*，吴 倩2

(1.无锡卫生高等职业技术学校护理系，江苏 无锡 214028； 2.中国药科大学药学院药理系，南京 210009)

研究报告

目的研究白藜芦醇对于大鼠血液高凝态形成的影响及其与NF-κB表达的关系。方法SD大鼠分空白组、模型组、白藜芦醇高剂量组(60 mg/kg)、白藜芦醇低剂量组(30 mg/kg)和阿司匹林组(10 mg/kg)，连续灌胃给药7 d，采用肾上腺素联合冰浴法和凝血酶法建立高凝态大鼠模型，采集血样测凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)及全血粘度；收集血管内皮细胞，采用蛋白印迹法测NF-κB表达情况。结果空白组、白藜芦醇高剂量组和阿司匹林组较模型组PT、APTT显著延长(P< 0.05)，血液粘度显著降低(P< 0.05)；白藜芦醇高剂量组血管内皮细胞NF-κB表达较模型组明显降低(P< 0.05)。结论高剂量白藜芦醇(60 mg/kg)可抑制大鼠血液高凝态形成，这种作用可能与其降低NF-κB的表达有关。

白藜芦醇；高凝态；NF-κB；大鼠

高凝态(hypercoagulable state)即中医理论中的血瘀证，是心血管疾病最常见的现象，具有血液凝固性增加、血液流变学异常等特点，血液高凝态人群的血栓栓塞率显著高于正常人[1，2]。研究发现白藜芦醇(resveratrol，RSV)可抑制大鼠动静脉旁路血栓和角叉菜胶小鼠致尾血栓的形成、延长小鼠凝血时间[3]；小鼠NF-κB水平提高时，其动脉血栓的发生显著增加[4]。但白藜芦醇对于高凝态的影响及其机制未见报道，本研究旨在探索白藜芦醇对于大鼠血液高凝态形成的影响，及其与NF-κB表达的关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠80只，雌雄各半，8周龄，体重180～220 g，由浙江省实验动物中心提供[SCXK(浙)2014-0001]，在中国药科大学药学实验动物中心进行实验操作[SYXK(苏)2016-0011]。所有动物于实验开始一周前适应新环境，每天保持光照、黑暗各12 h的正常昼夜节律，自由饮食，温度20～26℃，相对湿度40%～70%，并按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂及仪器

白藜芦醇购自中美华东制药有限公司(98%，HPLC)；阿司匹林购自湖北恒硕化工有限公司(98%，HPLC)；凝血酶购自湖南一格制药有限公司(批号130722-2)；盐酸肾上腺素注射液购自上海禾丰制药有限公司(批号：10141102)；水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司(批号：20150303)；PT试剂盒(冻干型)(批号：105252)、APTT试剂盒(批号：112176)购自上海太阳生物技术有限公司；NF-κB p65抗体购自Cell signal 公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司(批号：20160718)；DMEM 高糖培养基购自HyClone公司(批号：SH30243.01B)；Ⅰ型胶原酶购自Sigma公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司(批号： CW0014)；Western及IP细胞裂解液(批号：P0013)、超敏ECL化学发光试剂盒(批号：P0018)、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5×)(批号：P0015)购自上海碧云天生物技术有限公司；牛血清白蛋白(BSA)购自武汉谷歌生物科技有限公司(批号：G5001)。

AYW8003半自动凝血分析仪(南京瑞麦科技开发有限公司)；酶标仪(BIO-RAD 680)；SA-5600自动血流变测试仪(北京赛科希德科技发展有限公司)；Bio-Rad 电泳仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司)；5200 化学发光成像系统(上海天能科技有限公司)；常用玻璃、手术器皿等用具。

1.3 实验方法

1.3.1 白藜芦醇对肾上腺素联合冰浴法致高凝态大鼠的影响

40只SD大鼠随机分为五组，即空白组、模型组、白藜芦醇高剂量组(60 mg/kg)、白藜芦醇低剂量组(30 mg/kg)和阿司匹林组(10 mg/kg)，雌雄各半。各组均按 1 mL/100 g 给予药液或生理盐水，每天1次，连续7 d，第7天给药于采血前30 min进行。于第6天进行造模处理：除空白组外其他各组大鼠分别皮下注射盐酸肾上腺素溶液0.7 mg/kg；2 h后将大鼠置于4℃水浴游泳4 min；再2 h后皮下注射盐酸肾上腺素溶液0.7 mg/kg。空白组大鼠皮下注射等体积生理盐水；2 h给予常温水浴游泳4 min；再2 h后皮下注射等体积生理盐水。禁食不禁水饲养12 h后，各组大鼠按3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉，于颈总动脉取血，血样分为2份，分别置于含枸橼酸钠离心管制备血浆和含EDTA离心管内制备全血样品。血浆样品用于测定PT、APTT，全血样品用于血液流变学的测定。

1.3.2 白藜芦醇对凝血酶致高凝态大鼠的影响

40只SD大鼠分组同1.3.1，各组均按 1 mL/100 g 给予药液或生理盐水，每天1次，连续7 d。第7天给药后30 min，各组大鼠按3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉，分别于股静脉注射生理盐水和凝血酶10 U/kg，60 s后颈总动脉采血制备血浆、全血样品，测试PT、APTT和全血粘度。

1.3.3 蛋白质免疫印迹检测大鼠血管内皮细胞NF-κB表达

大鼠经1.3.2处理后，分离并剪下颈动脉、腹主动脉和下腔静脉，迅速转移至超净台，4℃预冷的1× PBS洗涤血管管腔除去血细胞，纵向剪开血管；于培养皿中加入1 mL胶原酶(1000 U/mL)，血管内膜朝下置于培养皿内，37℃ CO2孵箱孵育60 min；加入6 mL含20%胎牛血清的培养基冲洗血管内膜，转移溶液和血管至离心管，吹打数次后弃去血管，1000 r/min离心5 min收集内皮细胞；4℃预冷的1×PBS洗涤细胞3次，置于冰上，加入RIPA裂解液裂解30 min，转移裂解液及细胞碎片至1.5 mL离心管，4℃ 12 000 r/min离心15 min；收集上清，采用BCA法测定总蛋白浓度；取一定量蛋白上样，于10%聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，根据Marker切下目标蛋白所在部位凝胶，PVDE膜转膜处理，5%BSA封闭；加入NF-κB、β-actin抗体4℃孵育过夜；TBST洗涤3次；加入二抗室温孵育1 h；TBST洗涤三次；加入ECL化学发光试剂曝光显影，Image J 软件进行图像数据分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 白藜芦醇对肾上腺素冰浴致高凝态大鼠凝血指标和血液粘度的作用

各组大鼠经给药、肾上腺素联合冰浴造模处理后，其血浆PT、APTT数值如图1所示，血液粘度值如表1所示。同模型组相比，空白组与阿司匹林组PT值显著延长(P< 0.05)，白藜芦醇高剂量与低剂量组PT值与模型组差异无显著性。空白组、白藜芦醇高剂量组和阿司匹林组APTT值较模型组显著延长(P< 0.05)，而白藜芦醇低剂量组APTT值与模型组差异无显著性。低剪切力(5/s)和中剪切力(30/s)下，空白组、白藜芦醇高剂量组、阿司匹林组较空白组血液粘度降低，白藜芦醇低剂量组与空白组差异无显著性；高剪切力(200/s)下，各组与模型组均差异无显著性。

注：A：PT值；B：APTT值。同模型组相比，* P < 0.05。图1 白藜芦醇对肾上腺素联合冰浴致高凝态 大鼠血浆PT、APTT值影响Note.A: PT value；B: APTT value. Compared with model, * P < 0.05.Fig.1 Effect of resveratrol on the plasma PT and APTT values in rats with hypercoagulable state caused by adrenaline and ice bath表1 白藜芦醇对肾上腺素冰浴致高凝态大鼠血液粘度影响Tab.1 The effect of resveratrol on blood viscosity of rats with hypercoagulable state caused by adrenaline and ice bath

组别Group5/s30/s200/s空白组Control1466±073∗780±054∗558±046模型组Model1716±249931±086586±043RSV高剂量组RSV(H)1460±119∗840±056∗591±060RSV低剂量组RSV(L)1725±176892±102586±071阿司匹林组Aspirin1481±132∗820±085∗555±036

注：与模型组相比，*P< 0.05。

Note.Compared with the model group,*P< 0.05.

2.2 白藜芦醇对凝血酶致高凝态大鼠凝血指标和血液粘度的作用

各组大鼠经给药、凝血酶造模处理后，其血浆PT、APTT数值如图2所示，血液粘度值如表2所示。同模型组相比，空白组与阿司匹林组PT值显著延长(P< 0.05)，白藜芦醇高剂量与低剂量组PT值与模型组无明显差异。空白组、白藜芦醇高剂量组和阿司匹林组APTT值较模型组显著延长(P< 0.05)，而白藜芦醇低剂量组APTT值与模型组差异无显著性。低剪切力(5/s)下，空白组、白藜芦醇高剂量组、阿司匹林组较空白组血液粘度降低，白藜芦醇低剂量组与空白组差异无显著性；中剪切力(30/s)下，空白组、阿司匹林组较模型组血液粘度显著降低，白藜芦醇高剂量和低剂量组与模型组差异无显著性；高剪切力(200/s)下，各组与模型组均差异无显著性。

2.3 蛋白质免疫印迹检测白藜芦醇对高凝态大鼠血管内皮中NF-κB表达的影响

大鼠经给药、凝血酶造模后，血管内皮中NF-κB的表达情况如图3所示；空白组和白藜芦醇高剂量组NF-κB较模型组明显减少(P< 0.05)，白藜芦醇低剂量组和阿司匹林组与模型组差异无显著性。

3 讨论

高凝态或称血栓前状态(prethrombotic state)、促血栓状态(prothrombotic state)、促凝状态(procoagulant state)，因其诱发的动静脉血栓栓塞事件在全球特别是发达国家逐渐增加，近二十年来相关的研究越来越受到重视[5]。高凝态多见于恶性疾病患者、孕妇、房颤和人工关节置换及老年人等人群[6]。2010年，全球因血栓栓塞死亡的人数占据总死亡人数的25%[7]。血液高凝态具有很强的血栓形成趋势，但相关的研究及治疗措施较少，因此针对高凝态的治疗药物及相关机制研究具有重要意义。

注：A：PT值；B：APTT值。同模型组相比，* P < 0.05。图2 白藜芦醇对凝血酶致高凝态大鼠血浆PT、APTT值影响Note.A: PT value；B: APTT value. Compared with model group，* P < 0.05.Fig.2 Effect of resveratrol on the plasma PT and APTT values in rats with hypercoagulable state caused by thrombin表2 白藜芦醇对凝血酶致高凝态大鼠血液粘度影响Tab.2 Effect of resveratrol on the blood viscosity of rats with hypercoagulable state caused by thrombin

组别Groups5/s30/s200/s空白组Control1433±1．16∗775±110∗552±055模型组Model1695±2．50927±109589±045RSV高剂量组RSV(H)1452±1．05∗856±085575±063RSV低剂量组RSV(L)1680±1．37917±104556±060阿司匹林组Aspirin1442±1．35∗782±123∗546±031

注：与模型组相比，*P< 0.05。

Note.Compared with the model group,*P< 0.05.

注：A：蛋白质免疫印迹的结果；B：NF-κB与β-actin 光密度之比。同模型组相比，* P < 0.05。图3 白藜芦醇对凝血酶致高凝态大鼠血管内皮 NF-κB表达的影响Note.A: Result of western blotting；B: Optical density ratio of NF-κB/β-actin. Compared with the model group, * P < 0.05.Fig.3 Effect of resveratrol on the expression of NF-κB in vascular endothelial cells of rats with hypercoagulable state caused by thrombin

白藜芦醇是一种天然多酚化合物，最早发现于白藜芦根部，存在于多种植物如浆果、花生特别是葡萄皮内，具有抗炎、抗氧化、抗增殖、心血管保护等作用[8-10]。近年来研究发现，白藜芦醇通过降低血小板聚集、增加血管内皮细胞一氧化氮的合成具有抗血栓活性[3]；在实验性脑血栓研究中，白藜芦醇可减轻脑血栓引发的伊文氏蓝蓝染和脑水肿，对脑血栓的发生具有抑制作用[11]。NF-κB家族包含五个成员：RelA/p65、RelB, c-Rel、NF-κB 1/p50, and NF-κB 2/p52，其中NF-κB p50/p65异源二聚体是转录因子Rel家族的主要成员，非活性状态下NF-κB二聚体与IκB结合位于细胞质内，活化状态下NF-κB二聚体与IκB分离并转移入核[12,13]。小鼠动脉血栓研究发现，当NF-κB水平升高时，其血栓的发生显著增加[4]；大鼠下腔静脉结扎诱导深静脉血栓研究显示，正常静脉内皮细胞中NF-κB表达极低，深静脉血栓形成后其表达量明显增加[14]；此外，大鼠骨损伤静脉血栓的发生也伴随着内皮细胞NF-κB表达的增加[15]，说明NF-κB可能参与血栓的发生。因此，本研究旨在探索白藜芦醇对于大鼠血液高凝态的影响及NF-κB表达在其中的作用。

本研究以肾上腺素联合冰浴法和凝血酶法建立高凝态大鼠模型[16，17]，以PT、APTT和血液粘度为高凝态检测指标，以阿司匹林为阳性对照，探究白藜芦醇对于高凝态大鼠凝血相关指标及血管内皮表达NF-κB的影响。研究发现，模型组大鼠NF-κB/p65较空白组的表达明显增加(P< 0.05)，提示大鼠血液高凝态的形成可能与血管内皮细胞NF-κB/p65的表达增加有关；高剂量白藜芦醇(60 mg/kg)可显著延长高凝态模型大鼠的PT和APTT值，降低全血粘度，同时降低NF-κB/p65的表达(P< 0.05)，提示白藜芦醇抑制大鼠高凝态的形成可能与降低NF-κB的表达有关。综上所述，高剂量白藜芦醇(60 mg/kg)可抑制肾上腺素联合冰浴法和凝血酶法所致的大鼠血液高凝态形成，这种抑制作用可能与其抑制血管内皮NF-κB的表达有关。

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InhibitoryeffectofresveratrolonthehypercoagulablestateinratsanditsrelationshipwiththeexpressionofNF-κB

WANG Li-wen1， SHEN Xiao-jie1*， WU Qian2

(1.Department of Nursing, Wuxi Healthcare Vocational Technology School, Wuxi 214028, China； 2.Faculty of Pharmacology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009)

ObjectiveThe topic of this study was to study the inhibitory effect of resveratrol on hypercoagulable state in rats and its relationship with the expression of NF-κB.MethodsRats were divided into control and model groups, and resveratrol (high dose, 60 mg/kg), resveratrol (low dose, 30 mg/kg) and aspirin (10 mg/kg) were given by intragastric administration for 7 d. Then, the rats were treated by adrenaline with ice bath or thrombin to generate hypercoagulable state. Blood samples were collected to test the prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT) and blood viscosity. Vascular endothelial cells were collected to detect the expression of NF-κB by western blotting.ResultsPT and APTT values of rats in the control, resveratrol (high dose) and aspirin groups were significantly increased than the model group (P< 0.05). Blood viscosity of rats in the control, resveratrol (high dose) and aspirin groups was significantly lower than the model group (P< 0.05). The expression of NF-κB was decreased than that of the model group (P< 0.05).ConclusionsResveratrol in high dose (60 mg/kg) can inhibit hypercoagulable state of rat, which may be related with its effect on decreasing the expression of NF-κB.

Resveratrol; Hypercoagulable state; NF-κB; Rats

无锡市医院管理中心科研项目(YGZXM1533)。

王立文(1968-)，男，副教授，研究方向：外科、危急症教学。E-mail:jshywxwlw@aliyun.com

沈晓洁(1971-)，女，副教授，研究方向：病理、病理生理研究。E-mail: wxwxsxj@sina.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0079-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.014

2017-04-05