核因子-κB在新诊断2型糖尿病肥胖患者中的作用

孙 燕 饶惠平 李新荣 刘 军

广东省中山市南朗医院内科，广东中山 528451

核因子-κB在新诊断2型糖尿病肥胖患者中的作用

孙 燕 饶惠平 李新荣 刘 军

广东省中山市南朗医院内科，广东中山 528451

目的探讨核因子-κB在新诊断2型糖尿病肥胖患者中的作用。方法选择新诊断2型糖尿病患者50例来自内科住院（非肥胖者22例，肥胖者28例）。分离血标本外周单个核细胞检测其中NF-κB p65 mRNA表达水平，以β-actin为内参照。结果新诊断2型糖尿病肥胖组间血清炎症因子hsCRP高于非肥胖组（P＜0.01）；2型糖尿病肥胖组间NF-κB p65mRNA水平显著高于非肥胖组（P＜0.01）。Logistic回归分析提示NF-κB、hsCRP、TG与肥胖呈正相关（P＜0.05），HbA1C与肥胖呈负相关（P＜0.05）。结论NF-κB在新诊断2型糖尿病肥胖患者的表达水平升高，提示可能参与2型糖尿病肥胖患者炎症的发生。

糖尿病；肥胖；核因子-κB；C反应蛋白

肥胖症是引发心脑血管事件的高危风险因素及导致人类致死致残的主要原因之一，其主要病理生理特点是胰岛素抵抗以及高胰岛素血症[1]。多数存在2型糖尿病患者都存在肥胖症状以及不同程度的相关胰岛素抵抗情况，多认为胰岛素抵抗属于2型糖尿病肥胖患者的重要病理及生理相关因素[2]。核因子-κB是机体炎症有关的重要核转录相关因子，NF-κB所介导的有关炎症反应和肥胖的出现及发展存在一定相关关系[3]。本文对新诊断的存在2型糖尿病且肥胖的患者PMNC的NF-κB活性变化，有望为防治以胰岛素抵抗为基础的肥胖及相关性2型糖尿病提供新的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择自2015年7～12月南朗医院内科住院新诊断的2型糖尿病患者50例（根据1999年WHO糖尿病诊断标准和分型标准），分级2004年中华医学会糖尿病学分会建议[5]代谢综合征中肥胖的标准定义为体质量指数（body mass index，BMI）≥25kg/m2，根据患者BMI分为肥胖组和非肥胖组，其中肥胖组28例，非肥胖组22例，年龄25～60岁。所有入选者没有抗高血糖相关药物和调脂相关药物应用；无维生素A、维生素E、维生素C、阿司匹林和抗氧化相关药物应用；无ACEI相关药物、ARB相关药物应用；将存在肺、心、肝以及肾等相关疾病的患者排除；将存在急性感染患者、慢性感染患者排除；将存在恶性的肿瘤相关疾病的患者排除。

1.2 方法

1.2.1 对于受试者的疾病史情况、吸烟史情况、家族史情况进行统计，对于受试者的血压数值、心率数值、身高数值、体重数值、腰围数值、臀围数值进行测定，对其腰臀比（WHR）、体质量指数（BMI）进行计算。检测血尿常规、肝肾功能。所有对象均进行OGTT（75g无水葡萄糖）。

表1 两组一般情况的比较

1.2.2 所提取得到的PMNC Ficoll淋巴细胞分离液使用密度梯度离心法予以PMNC分离，使细胞数量保持3.2×106个。血液标本应用肝素予以抗凝处理，予以PBS缓冲液的稀释处理，1∶1比例叠加于Ficoll相关淋巴细胞的分离液中，于温度为20℃的情况下以2000r/min的转速进行离心共20min，可以看到液体由上至下分成4层，吸取中间的白膜层，将2倍体积的PBS加入，以1000r/min的转速进行离心共10min，共洗涤2次，将上清弃去后得到所需的细胞。

1.2.3 提取DNA 采用深圳创益生物科技有限公司人全血基因组DNA提取试剂盒取300μL裂解液至各样EP管中，取50μL PMNC加至相应编号的EP管中，振荡摇匀，放置10min，12 000rpm离心3min，弃上清；加入0.4mL洗涤液A，振荡混匀，离心3min，弃上清；加入0.6mL洗涤液B，振荡混匀，离心3min，弃上清；加入0.6mL无水乙醇，振荡混匀，离心3min，弃上清，收集沉淀；加入80μL TE液缓冲，振荡悬浮沉淀，12 000rpm离心3min，-70℃保存沉淀。

1.2.4 应用RT-PCR对NF-κB p65相关mRNA的含量予以测定。

1.2.4.1 引物的设计方法 应用Primer5.0相关软件对于本研究所使用的引物予以设计处理。NF-κB p65相关的引物序列是：本研究所使用的NF-κB p65上游的引物是：5’-AGTGAGCCCATGGAATTCCAGTACC-3’； 本研究所使用的NF-κB p65下游的引物是：5'-CCACTGCGGACGGGAGGGGTCTCGT -3’，本研究所使用的NF-κB p65扩增产物是426bP。β-actin相关的引物序列是：本研究所使用的β-actin上游 的 引 物 是：5’ -TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3’；本研究所使用的β-actin下游的引物是：5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3’，本研究所使用的β-actin扩增产物是302bP。

1.2.4.2 PCR DNA 模板 5μL，10×buffer 2.5μL，dNTP 0.5μL，上、下游引物各 0.25μL，酶混合物0.25μL，如果体积不够使用灭菌的双蒸水予以补加处理，保证相关体积数值，并使总的体积数值是25μL。在温度为94℃的情况下予以预变性处理共2min。在94℃下进行预变性共30s，在58.6℃下进行退火共30s，在72℃下进行延伸处理共60s，予以35个循环处理，在末次的循环后于温度为72℃的情况下进行延伸处理共10min。

1.2.4.3 PCR产物的相关半定量处理方法 PCR的相关产物一共有8μL，将其和和6×核酸的相关上样缓冲液和SYBR GreenⅠ相关染料一共2μL予以混匀处理，并加入20g/L的琼脂糖电泳，分析电泳条带的相关感光密度数值，应用NF-κB p65和β-actin之比表示NF-κB 相关mRNA具体表达量数值[4]。

1.3 统计学方法

本研究数据使用SPSS19.0 for Windows统计软件包上完成。计量资料以（x±s）表示，采用t检验，予以自然对数的转换处理。多元回归分析用Logistic法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分析2型糖尿病肥胖患者的临床特点

新诊断2型糖尿病肥胖组与非肥胖组间年龄、收缩压、舒张压、LDL-C、HDC-C、空腹血糖、OGTT 2h血糖、糖化血红蛋白差异无统计学意义（P＞0.05）；肥胖组腰围（P＜ 0.01）、臀围（P＜ 0.01）、总胆固醇（P＜0.01）、三酰甘油（P＜0.01）均高于非肥胖组。

2.2 hs-CRP水平

新诊断2型糖尿病肥胖组间血清炎症因子hsCRP高于非肥胖组（P＜0.01）。见表2。

2.3 NF-κB p65 mRNA水平

新诊断2型糖尿病肥胖组间NF-κB p65mRNA水平显著高于非肥胖（P＜0.01）。见图1、表2。图1显示了NF-κB p65 mRNA印迹图。

表2 两组hs-CRP 、 NF-κB p65 mRNA 表达水平

图1 两组间NF-κB p65 mRNA的表达

2.4 肥胖影响因素Logistic回归性分析

NF-κB与肥胖呈正相关（OR=5.771,95%CI1.461～22.797，P＜ 0.05），hsCRP与肥胖呈正相 关（OR=5.260,95%CI2.087～ 13.252，P＜0.05），TG与肥胖呈正相关（OR=6.210,95%CI1.591～24.243，P＜0.05），HbA1C与肥胖呈负相关（OR=0.518,95%CI0.326～ 0.822，P＜ 0.05）。

3 讨论

因为人们生活方式的变化，近年来，2型糖尿病患者的发病率得到明显提升。相关流行病学的研究表面，2型糖尿病患者大多数是比较肥胖以及存在胰岛素抵抗的，提示肥胖有可能为2型糖尿病患者的重要危险因素[5-7]，所以，肥胖在胰岛素抵抗以及糖尿病中的相关作用逐渐得以人们关注。本文的研究结果提示新诊断2型糖尿病肥胖组总胆固醇、甘油三酯高于非肥胖组（P＜0.05），说明糖尿病伴存肥胖的患者体内的体脂分布存在异常情况。而体脂分布的异常和肥胖有关的疾病的相关患病率和病死率均存在相关关系。存在肥胖的患者其体内游离的脂肪酸水平提升，导致患者体内有胰岛素抵抗出现，发生高胰岛素相关血症以及糖耐量相关异常状况，导致2型糖尿病的发生。

本研究结果发现，2型糖尿病肥胖组间血清炎症因子hsCRP高于非肥胖组（P＜0.01），肥胖相关影响因素使用Logistics回归性分析发现，hsCRP和肥胖存在正相关的关系（OR为5.260，95%CI2.087～13.252，P＜0.05），这就提示了肥胖患者处于炎症状态。肥胖患者的BMI提高，其CRP也提升，且CRP的提升和内脏脂肪相关体积存在关系[8-10]。

NF-κB介导炎症相关反应和肥胖的出现具有一定的关系。本文研究中，2型糖尿病肥胖患者NF-κB p65mRNA表达高于非肥胖者（P＜0.01），肥胖影响因素Logistics回归性分析提示NF-κB与肥胖呈正相关（OR=5.771，95%CI1.461～22.797，P＜0.05），提示新诊断2型糖尿病肥胖患者NF-κB表达升高，且NF-κB与肥胖相关。研究显示控制饮食使肥胖患者体重的减少、PBMC中NF-κB有关的DNA结合的相关活性减少。笔者研究结果也提示了NF-κB对于肥胖患者的发病有可能参与其中[11-15]。

综上所述，本研究结果提示糖尿病肥胖患者处于炎症状态，NF-κB与肥胖相关。NF-κB在肥胖引起胰岛素抵抗相关发病机制之中存在介质作用，能从不同相关信号通路中经由不同机制对胰岛素相关生理功能进行干扰，可能参与了肥胖炎症的发生，因此深入研究NF-κB对肥胖的作用有助于更好地了解肥胖的发病机制及为相关疾病的防治开辟新的途径。

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Role of nuclear factor-κB in newly diagnosed obese patients with type 2 diabetes mellitus

SUN Yan RAO Huiping LI Xinrong LIU Jun
Department of Internal Medicine,Nanlang Hospital of Zhongshan City,Guangdong Province,Zhongshan 528451,China

ObjectiveTo investigate the role of nuclear factor-κB in newly diagnosed obese patients with type 2 diabetes mellitus.MethodsFifty patients with newly diagnosed type 2 diabetes were hospitalized from internal medicine（non-obese group 22,obese group 28）.The expression of NF-κB p65 mRNA was detected by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs),and β-actin was used as internal reference.ResultsThe serum levels of hsCRP in newly diagnosed obese patients with type 2 diabetes mellitus were higher than non-obese group (P＜0.01).The expression of NF-κB p65mRNA in newly diagnosed obese patients with type 2 diabetes mellitus is significantly higher than that of non-obese group (P＜ 0.01). Logistic regression analysis showed that NF-κB, hsCRP and TG were positively correlated with obesity (P＜0.05),and HbA1C was negatively correlated with obesity (P＜0.05).ConclusionThe expression of NF-κB in newly diagnosed type 2 diabetes mellitus High, suggesting that may be involved in type 2 diabetes obesity in patients with inflammation.

Diabetes;Obesity;Nuclear factor-κB;C-reactive protein

R587.1

A

2095-0616（2017）23-185-04

广东省中山市卫计局医学科研项目（2015A020191）。

2017-09-26）