LAMP技术检测社区获得性非典型肺炎中的嗜肺军团菌感染

李辉腾 郭旭光 柯茂彬 黎卓华 磨慧玲 吴丽川 李亚东

1.广东同江医院检验科，广东佛山528300；2.广州医科大学附属第三医院检验科，广东广州510150

LAMP技术检测社区获得性非典型肺炎中的嗜肺军团菌感染

李辉腾1郭旭光2柯茂彬1黎卓华1磨慧玲1吴丽川1李亚东1

1.广东同江医院检验科，广东佛山528300；2.广州医科大学附属第三医院检验科，广东广州510150

目的探讨环介导恒温扩增技术检测社区获得性肺炎非典型病原体嗜肺军团菌感染的可行性。方法收集195例CAP患者急性期双份合格痰液标本，一份痰液标本用作嗜肺军团菌分离培养，一份痰液标本经处理后-80℃保存至DNA提取运用LAMP技术及荧光定量PCR检测，验证LAMP试验方法的敏感性、特异性及可行性。结果195例痰培养嗜肺军团菌检出率1.54%（3/195），荧光定量PCR灵敏度达10-3/mL，检出率8.72%（17/195）；LAMP方法学灵敏度达10-7/μL，检出率9.23%（18/195）；两者阳性符合率94.44%（17/18），两者阴性符合率99.44%（177/178），两者总符合率99.49%（194/195）。结论采用LAMP技术检测临床痰液标本中的嗜肺军团菌具有高度的特异性和敏感性，实验时间约1.5h且操作简便，更合适基层医院开展。

LAMP技术；社区获得性非典型肺炎；嗜肺军团菌；痰培养

社区获得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）是指于院外罹患的肺实质感染性严重疾病，按致病菌不同又可将疾病分为典型性与非典型性[1]。前者致病菌以肺炎链球菌最多见[2]，而非典型性则以肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌多见。由于嗜肺军团菌（legionella pneumophila，Lp）生长缓慢且要求严苛，因此传统的细菌培养阳性率低、操作繁琐、耗时长，难以在临床普及开展[3]。目前使用比较多检测嗜肺军团菌的方法学有荧光定量PCR、血清免疫学检测、尿抗原检测等[4-5]。本研究是采用环介导恒温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）技术原理针对嗜肺军团菌mip特异性基因设计出一套引物在一定条件下对社区获得性非典型肺炎患者临床痰液标本进行检测，现将实验报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年1月～2017年6月本院及广州医科大学附属第三医院CAP患者共195例，所纳入患者均符合社区获得性非典型性肺炎诊断标准[6]。大部分患者有顽固性咳嗽，入院前咳嗽5～10d经抗生素治疗未见明显好转，上述患者留取急性期双份合格痰液标本。

1.2 菌株来源

嗜肺军团菌临床分离菌株（广州微生物研究所赠）

1.3 主要试剂与仪器

嗜肺军团菌选择培养基GVPC平板，确认培养基BCYE平板及BCYE-cys平板（广东环凯微生物科技有限公司）。嗜肺军团菌核酸检测试剂盒（上海之江），细菌基因组核酸提取试剂盒（广州双螺旋基因技术有限公司）。嗜肺军团菌LAMP引物（上海生工生物工程有限公司合成）。全自动细菌培养仪（BD9120）鉴定仪（PHOENIX-100），5%CO2培养箱（上海精宏HF212），荧光定量PCR仪ABI Prism 7300（美国），ZYD-S1恒温荧光检测仪（广州双螺旋基因技术有限公司），-80℃深低温冰箱（海尔DW40L262），干式恒温仪（黑马 H-I），显微镜（奥林巴斯CX31）等。

1.4 方法

1.4.1 嗜肺军团菌痰培养 将合格痰液标本接种于GVPC平板放于36℃5%CO2培养箱，每天观察平板上菌落生长情况。如果GVPC平板有菌落生长则上挑取灰白色、大小适中、圆形稍凸、湿润、有光泽和粘稠的菌落1～2个，做革兰染色。把革兰染色阴性的菌落接种BCYE和 BCYE-cys（不含L-半胱氨酸）平板，36℃，5%CO2培养2～3天，凡在BCYE琼脂平板上生长而在BCYE-cys琼脂上不生长的则为军团菌菌落。

1.4.2 荧光定量PCR检测 取痰液加入4倍体积的4%NaOH，摇匀，室温下放置30min液化，取0.5mL样品于离心管中，再加入0.5mL 4%NaOH 室温放置10min后13 000rpm离心5min。沉淀加无菌生理盐水1mL打匀，13 000rpm离心5min：再重复洗涤一次。去尽上清，沉淀物中直接加入50μL DNA提取液充分混匀，100℃恒温10min再13 000rpm离心5min，取上清4μL做PCR反应模板，根据Ct值判断结果：待测样品Ct值≤35，检测结果报为阳性；待测样本Ct值显示在35～40之间，需重复测定，Ct值仍在35～40之间，且扩增曲线呈典型的S型，则判断为阳性；若非典型S型曲线，则判为阴性。

1.4.3 嗜肺军团菌LAMP引物设计 选取嗜肺军团菌具有高度保守性的mip特异基因，采用LAMP引物设计软件Primer Explorer version4设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列为：

F3-GTTGTTGTATTGCCAAGTGG，B3-TTTCATTTGGGCCAATAGGT

FIP（F1c+F2）-ACGTTGCTGGCTTACCAGTTA GTCACTGTCGAATATACTGGT

BIP（B1c+B2）-TGGATGGACAGAAGCTTTGCA CCATATGCAAGACCTGAGG

LoopF-ACGGTACCATCAATCAGACG，LoopBAGCTGGATCAACTTGGGAAAT

1.4.4 LAMP反应体系 将合成的引物均配制成内引物：外引物：环引物浓度比为40 μM：5 μM：20μM的引物混合液，然后取1μL进行恒温扩增反应。25μL反应体系含有：引物混合液PM 1μL，2× 反应液 12.5μL，Bst聚合酶 8U，荧光染料SYTO-9 0.5μL，待检样品2μL，用超纯水补齐至25μL，加入密封液20μL，反应条件63℃时间45min。根据扩增曲线呈典型的S型则判断为阳性，若非典型S型曲线，则判为阴性。

1.4.5 采用LAMP技术对临床痰液标本检测 收集195例临床痰液标本经液化处理后提取的DNA标本从-80℃深低温冰箱取出，采用嗜肺军团菌菌株DNA（107拷贝/mL）作为阳性对照，非嗜肺军团菌DNA（107拷贝/mL）作为阴性对照，反应条件63℃时间45min。

2 结果

2.1 特异性实验

分别提取嗜肺军团及其他常见病原菌金黄色葡萄球菌，伤寒沙门氏菌，阪崎肠杆菌，单核细胞增生李斯特氏菌，福氏志贺氏菌，大肠埃希氏菌，副溶血性弧菌，铜绿假单胞杆的基因组DNA，按照设计的反应条件进行扩增，只有嗜肺军团菌菌株出现“S”扩增曲线，非嗜肺军团菌及阴性对照均呈阴性结果。见图1。

图1

2.2 敏感性实验

提取嗜肺军团菌基因组DNA浓度为1ng/μL依次稀释至 100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL后作为模板进行实验。实验结果表明敏感性可达100fg/μL即 10-7/μL，比荧光定量 PCR10-3/mL检测限（试剂说明书）高。

2.3 195例痰液标本进行传统痰培养只检出嗜肺军团菌3例阳性，检出率1.54%（3/195），采用荧光定量PCR检出17例阳性，检出率8.72%（17/195），LAMP方法学检出18例阳性检出率9.23%（18/195）。荧光定量 PCR法和 LAMP技术两者阳性符合率94.44%（17/18），两者阴性符合率99.44%（177/178），两者总符合率99.49%（194/195）。见图 2。

图2

3 讨论

随着社区获得性肺炎的发生率愈渐攀升，其相关研究已成为热点[7]。嗜肺军团菌广泛存在于空调系统冷却水、泳池水、环境水源等是社区获得性非典型性肺炎的重要病原体之一，据范志强等报道其在社区获得性非典型性肺炎中占比可达5%左右[8-9]。军团菌肺炎潜伏期2～10d有明显的肺外症状该病在早期X线胸片无特征性改变[10]，因此，仅依据临床表现难以确诊。病原体分离培养作为诊断嗜肺军团菌的金标准，虽诊断价值高，但由于嗜肺军团菌属于苛养菌需要特殊培养基且生长极为缓慢，因此，不具快速检测优势[11]。另一种早期检测方式，尿抗原检测通过浓缩尿标本虽可在一定程度上增加检测的敏感度，但无法检出Lp以外的血清型，加之尿抗原排出时间相对较长，也增加对感染时间的判断难度[12]。

荧光定量PCR快速检测法的最大优势在于快速、便捷[13]，直接规避了病原体分离培养的时间局限，但对实验室设备要求比较高对基层医院难以普及开展。本研究采用LAMP技术原理针对嗜肺军团菌mip特异性基因设计独特引物对嗜肺军团菌具有高灵敏度、高特异性，添加环引物使扩增反应更快，而添加新型荧光染料SYTO-9后不需要进行电泳直接在恒温荧光检测仪就能直观判断出结果。为进一步探索本实验方法的应用价值，本研究将其与痰培养及荧光定量PCR法等进行对比。结果提示，LAMP技术能检测出痰培养及荧光定量PCR法所检出的嗜肺军团菌阳性标本。而荧光定量PCR检测不出的另一例阳性标本可能是其他种或血清型嗜肺军团菌菌株或者是基于灵敏度原因。PCR及LAMP两种方法同样具备高度特异性，但LAMP在特异性、灵敏度具显著优势，且重复性更佳，稳定性更强。该方法扩增及检测过程均于同一闭管内进行，不仅降低标本污染风险，降低假阳性发生率，同时检测结果直观可判，且整个检测过程约90min内便可完成，更符合社区获得性肺炎诊治指南中要求的4h内住院指导[14]。临床依据病原学诊断立即采取对症治疗可使病程迅速得以控制。

综上所述，采用LAMP技术检测嗜肺军团菌具备准确、快速便捷，对实验室条件及检验技师的操作技能要求相对较低，易于临床开展，尤其值得社区医院推广。

据任红宇等[15]报道现已发现嗜肺军团菌超过20个种和血清型可以引起人类疾病，并不断有新的种属从环境中分离及被鉴定。本次研究不足之处在于未能确所设计的引物是否能检出可引起人类军团菌肺炎的嗜肺军团菌所有血清型，这问题值得继续探索研究。

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Detection of Legionella pneumophila infection in communityacquired atypical pneumonia by LAMP technique

LI Huiteng1GUO Xuguang2KE Maobin1LI Zhuohua1MO Huiling1WU Lichuan1LI Yadong1
1.Department of Clinical Laboratory,Guangdong Tongjiang Hospital,Foshan 528300;2.Department of Clinical Laboratory,the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510150

ObjectiveTo investigate the feasibility of detecting the infection of Legionella pneumophila in the atypical pathogens of community acquired pneumonia by loop mediated constant temperature amplification.MethodsTwo qualified sputum specimens were collected from 195 patients with CAP in acute stage,one sputum specimen was used for isolation and culture of Legionella pneumophila,one sputum sample was stored at -80℃ for DNA extraction and detected by LAMP technique and fluorescence quantitative PCR.the sensitivity,specificity and feasibility of LAMP test method are verified.ResultsThe detection rate of Legionella pneumophila in 195 cases of sputum culture was 1.54% (3/195).The sensitivity of fluorescence quantitative PCR was 10-3/mL and the detection rate was 8.72% (17/195).The sensitivity of the LAMP method was 10-7/L,and the detection rate was 9.23%(18/195).The positive coincidence rate of both of them was 94.44% (17/18) and the negative coincidence rate of both of them was 99.44%(177/178) and the total coincidence rate of both of the two was 99.49% (194/195).ConclusionDetection of Legionella pneumophila in clinical sputum samples by LAMP technique has high specificity and sensitivity,the experimental time is about 1.5h and the operation is simple and convenient,which is more suitable for primary hospitals.

Lamp technology;Community acquired atypical pneumonia;Legionella pneumophila;Sputum culture

R563.1

A

2095-0616（2017）23-113-04

广东省佛山市医学类科技攻关项目（2015AB002593）。

2017-11-08）