一测多评法与外标法测定养血止疼丸中3种丹参酮类成分

武爱玲

(1 河南省洛阳正骨医院，洛阳，471002； 2 河南省洛正药业有限责任公司，洛阳，471013)

一测多评法与外标法测定养血止疼丸中3种丹参酮类成分

武爱玲1,2

(1 河南省洛阳正骨医院，洛阳，471002； 2 河南省洛正药业有限责任公司，洛阳，471013)

目的：采用一测多评法测定养血止疼丸中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量，验证一测多评法(QAMS)的适用性。方法：以丹参酮ⅡA为内参物，建立其与丹参酮Ⅰ、隐丹参酮的相对校正因子，考察不同仪器、不同色谱柱对相对校正因子的影响。分别用外标法测定丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量，后者与计算值进行比较。结果：10批养血止疼丸中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量可以用一测多评法进行测定，隐丹参酮、丹参酮Ⅰ含量的计算值与实测值间无显著差异。结论：一测多评法可用于养血止疼丸中丹参酮类成分的含量测定。

一测多评；高效液相色谱法；养血止疼丸；丹参酮

一测多评法是通过测定中药中一种代表性成分的含量，依据相对校正因子推算该中药中多种待测成分含量[1-3]，并使计算值与实测值满足定量方法学要求的一种多指标成分同步含量测定方法。“一测多评”法作为一种适合中药特点的多指标质量评价新模式，到目前为止，已在木瓜[4]、虎杖[5]、黄柏[6]、甘草[7]等单味中药材，以及金银花复方制剂[8]、复方丹参片[9]、穿心莲及其制剂[10]、湿疹软膏[11]等制剂的多指标含量测定中得到应用。

养血止疼丸是河南省洛阳正骨医院内部制剂，处方组成：丹参、鸡血藤、香附等，具有活血行气，温经通络。用于血瘀寒凝、膝关节骨质增生引起的膝关节疼痛、肿胀、活动受限等症。丹参是其主要药味，隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA均是丹参中脂溶性成分，具有扩张血管，改善微循环，抑制血小板凝集等作用。为建立养血止疼丸的多成分含量测定方法，本文建立了养血止疼丸中丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮的一测多评测定方法，并对一测多评法用于养血止疼丸中丹参酮类成分含量测定的可行性进行了分析。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪，2998 PDA Detector(美国Waters公司)，Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；METTLER AE200电子分析天平，AB135-S型梅特勒拖利多电子天平。色谱柱：Waters Symmetry C18，Inertsil® ODS-3，Agilent Pursuit5 C18，Wondasil® C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)。

1.2 试剂 对照品：中国食品药品检定研究院隐丹参酮(批号：110852-200806)、丹参酮Ⅰ(批号：110867-200406)、丹参酮ⅡA(批号：110766-200619)。水为蒸馏水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.3 分析样品 10批养血止疼丸，均由河南省洛阳正骨医院制剂科提供。

2 方法与结果[12-18]

2.1 色谱条件 Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇-水(75∶25)为流动相；检测波长为268 nm，柱温为20 ℃；进样量：10 μL。以丹参酮ⅡA峰计理论塔板数不低于3 000。

2.2 对照品溶液的制备 精密称定隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品，置容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，得浓度分别为20.5、20.3、19.8 μg/mL对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取养血止疼丸细粉约0.4 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，并称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，得续滤液。

图1 混合对照品(A)、养血止疼丸样品(B)和阴性样品(C)的色谱图

注：1一丹参酮I；2一隐丹参酮；3一丹参酮ⅡA

2.4 专属性试验 取缺丹参的阴性样品，按供试品溶液的方法制备，即得阴性对照液。在选定条件下，混合对照品和样品中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA分离良好，而阴性对照显示无干扰。见图1。

2.5 线性关系考察 精密吸取对照品溶液20、15、10、5、2、1 μL进样，以进样量(X)对峰面积(Y)进行线性回归，丹参酮Ⅰ的线性方程是Y=223.05X+10.27(r=0.999 7)，线性范围0.0203～0.406 μg；隐丹参酮的线性方程是Y=192.71X+7.56(r=0.999 8)，线性范围0.0205～0.410 μg；丹参酮ⅡA的线性方程是Y=269.33X+1.83(r=0.999 9)，线性范围0.0198～0.396 μg；表明3种丹参酮类成分在各浓度范围内与色谱峰面积的线性关系良好。

2.6 相对校正因子计算 内参物定为丹参酮ⅡA，参照相对校正因子的公式计算丹参酮Ⅰ、隐丹参酮相对丹参酮ⅡA的相对校正因子。见表1。

表1 丹参酮类成分相对校正因子

相对校正因子RCFs/k=fs/k=Ws.Ak/As.Wk；s为内参物，k为待测组分。

2.7 中间精密度试验 取“2.2”项下的对照品溶液，进样5次，每次10 μL，分析得丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的峰面积积分值。其相对标准偏差(RSD)分别为0.39%、0.82%、0.67%。表明仪器较为稳定。

2.8 供试品溶液稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0、4、6、8、12、16、20 h进样10 μL，进行分析。丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的RSD分别为1.30%、1.96%、0.89%，表明在20 h内供试品溶液稳定。

2.9 重复性试验 取同一批号养血止疼丸6份,按“2.3”项下方法制成供试品溶液，每份进样10 μL，测定隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA峰面积积分值。结果RSD为1.11%、0.78%、085%，显示该方法具有良好的重复性。

2.10 回收率试验 取0.2 g已知含量的养血止疼丸6份，分别加入适量的混合对照液，分别用“2.3”项下的方法制得供试品溶液，按照“2.1”条件测定。结果丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的平均回收率分别为100.2%、99.87%、101.9%，RSD分别为1.65%、1.37%、0.96%。

2.11 校正因子的重复性考察 1)色谱柱及高效液相色谱仪考察：精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液20、15、10、5、2、1 μL，进行测定，以丹参酮ⅡA为内参物，按“2.6”项下计算丹参酮Ⅰ、隐丹参酮的相对校正因子。见表2。结果表明，相对校正因子在不同色谱系统和不同品牌色谱柱下具有良好的适应性。2)待测组分色谱峰的定位：试验中利用3个成分色谱行为的不同，以丹参酮ⅡA为基准峰计算各个化合物的相对保留时间，即确定其在色谱图中的位置。相对保留值rk/s=tR(k)/(tR(s)，tR(k)：某指标成分的保留时间，tR(s)：内标的保留时间。见表3。

表2 不同仪器和色谱柱测得相对校正因子

表3 不同仪器和色谱柱测得相对保留值

2.12 样品测定结果 按“2.3”项下方法制备了10批养血止疼丸供试品溶液，分别精密吸取10 μL进样分析。采用外标法和“一测多评”法分别计算丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量。见表4。对所得结果用t检验进行比较，表明外标法和QAMS法测定结果无显著性差异，将“一测多评”法用于养血止疼丸中丹参酮类成分的含量测定是可行的。

3 讨论

由于丹参酮类成分受热不稳定，故未考察热提取方式。试验采用对样品用甲醇超声处理30 min。并考察了提取溶剂的用量，结果表明，甲醇在30、40、50 mL时测得的丹参酮I、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量差异无统计学意义(P>0.05)，说明甲醇用量对丹参酮类各成分的提取效率无显著影响。最后确定甲醇用量为30 mL。

流动相的选择，试验对5种展开系统进行了考察。曾采用甲醇-水(70∶30)、乙腈-0.02%磷酸溶液(80∶20)、乙腈-水(75∶25)等不同流动相，结果测定流动相为甲醇-水(75∶25)时丹参酮类成分峰形良好，可达到基线分离，与相邻峰分离度较好。

本试验的重点是色谱峰的专属性和校正因子问题。实验中3个丹参酮类成分在不同柱子和仪器上出峰时间有所变化，保留时间差之间有差异。但以丹参酮ⅡA为基准峰计算的各个化合物的相对保留时间值变化不大，所以利用相对保留值能较好的解决各化合物的定位问题。

本实验只考察了丹参酮类3个成分的相对校正因子，且3个成分都属于同一类化合物。在后续实验中将采用一测多评法对不同类化合物之间的校正因子和专属性进行研究。

表4 外标法和QAMS法测定养血止疼丸中3种丹参酮类成分含量(mg/g)

[1]沈小钟,刘瑶,杨燕,等.一测多评法研究进展[J].中国药业,2013,22(13):1-5.

[2]王欣,覃瑶,王德江,等.一测多评法在中药质量控制中的应用进展[J].中成药,2016,38(2):395-402.

[3]范成杰.“一测多评”法在中药质量评价和控制中的应用概况[J].中药与临床,2013,4(2):18-20.

[4]张勇,张玲,谢晓梅.一测多评法同时测定木瓜中2种常见三萜酸[J].中成药,2013,35(4):770-773.

[5]范玲,严冬,李爽,等.一测多评法测定虎杖中虎杖苷、白藜芦醇、大黄素及大黄素甲醚的含量[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(7):103-107.

[6]吴珊珊,胡昌江,吕非非,等.一测多评法测定黄柏中5种生物碱[J].中成药,2014,36(1):130-134.

[7]刘香南,李明珠,尚晓娜,等.一测多评法测定甘草中6种有效成分含量[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(24):56-59.

[8]朱粉霞,张亚丽,汪晶,等.一测多评法测定金银花复方制剂中新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸[J].中成药,2013,35(12):2666-2671.

[9]吴笛,臧忠良,王德勤,等.一测多评法测定复方丹参片中4种丹参酮类成分的含量[J].中国药学杂志,2012,47(18):1509-1513.

[10]林青,匡艳辉,黄琳等.一测多评法测定穿心莲及其制剂中内酯类成分[J].中草药,2012,43(12):2406-2411.

[11]魏凤环,吴桂欣,朱清利,等.一测多评法测定湿疹软膏中欧前胡素、异欧前胡素的含量[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(21):125-128.

[12]李晓翠,苗爱东.一测多评法测定复方土荆皮酊中3种二萜类成分的含量[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(17):77-80.

[13]池絮影,崔曰新,张蜀,等.一测多评法测定板蓝根颗粒中4种成分的含量[J].中国生化药物杂志,2015,10(35):137-140.

[14]符映均,胡浩彬.一测多评法测定倍力舒合剂中4种三萜酸的含量[J].南京中医药大学学报,2015,3(31):277-279.

[15]黄渭,王奕.一测多评法测定菊花中3个指标成分含量[J].医药导报,2016,35(6):645-649.

[16]郭燕娜,胡华杰.一测多评法测定垂盆草颗粒中槲皮素、山奈素与异鼠李素含量[J].中国生化药物杂志,2016,4(36):199-202.

[17]朱卫敏,李玲,孙莲,等.一测多评法测定新疆药桑叶中4种活性成分的含量[J].西北药学杂志,2016,31(1):15-18.

[18]黄丽,万佐玺.一测多评法同时测定酸枣仁中4种皂苷类成分的含量[J].中国药师,2016,19(6):1073-1076.

SimultaneousDeterminationof3TanshinonesinYangxueZhitengPillbyQAMS

Wu Ailing1,2

(1HenanLuoyangOrthopedic-TraumatologicalHospital，Luoyang471002，China; 2HenanLuozhengPharmaceuticalLimitedLiabilityCompany，Luoyang471013，China)

Objective:To determine the contents of three tanshinones in Yangxue Zhiteng Pill by QAMS and to validate its feasibility.MethodsThe tanshinone IIA as the internal reference substance，the relative correction factor of tanshinone I and cryptotanshinone were determined by HPLC on different instruments and chromatographic columns.The content of tanshinone IIA in Yangxue Zhiteng Pill was authentically determined by the external standard method，and the content of tanshinone I and cryptotanshinone was calculated by external standard method and relative correction factor respectively.ResultsThe QAMS could determine the content of tanshinone I，cryptotanshinone and tanshinone IIA.No significant differences between the quantitative results of QAMS and external standard method were observed.ConclusionThe QAMS can determine the quality of content of tanshinone in Yangxue Zhiteng Pill.

Quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS); HPLC; Yangxue Zhiteng Pill; Tanshinone

河南省洛正药业有限责任公司科技攻关资助项目(LZZKJ-BZ-032)——养血止疼丸质量控制标准提高研究

武爱玲(1978.05—)，女，硕士，主管药师，研究方向：中药制剂开发与研究，E-mail：wal2317@163.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.055

(2016-08-15收稿 责任编辑：张文婷)