乙肝病毒X蛋白结合蛋白对腺样囊性癌细胞株ACC-2生物学行为的影响

孟雪，齐晓宇，刘维贤，王瑶 ，王秋旭

（1. 中国医科大学附属盛京医院口腔颌面外科，沈阳 110004； 2. 辽宁省铁法煤业集团总医院口腔科，辽宁 铁岭 112000； 3. 沈阳农业大学畜牧兽医学院预防兽医学教研室，沈阳 110866）

乙肝病毒X蛋白结合蛋白对腺样囊性癌细胞株ACC-2生物学行为的影响

孟雪1，齐晓宇2，刘维贤1，王瑶3，王秋旭1

（1. 中国医科大学附属盛京医院口腔颌面外科，沈阳 110004； 2. 辽宁省铁法煤业集团总医院口腔科，辽宁 铁岭 112000； 3. 沈阳农业大学畜牧兽医学院预防兽医学教研室，沈阳 110866）

目的探讨乙肝病毒X蛋白结合蛋白 （HBXIP） 对腺样囊性癌细胞株ACC-2生物学行为的影响及其机制。方法采用siRNA转染法抑制腺样囊性癌细胞株ACC-2中HBXIP的表达；实时PCR和Western blotting检测HBXIP基因及蛋白表达水平；MTT法检测HBXIP-siRNA对细胞增殖的影响；transwell法检测HBXIP-siRNA对细胞侵袭的影响；划痕实验检测HBXIP-siRNA对细胞迁移的影响；蛋白印迹方法检测HBXIP-siRNA对PI3K/Akt信号通路中Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K及对S100A4蛋白表达量的影响。结果HBXIP在ACC-2中高表达，HBXIP-siRNA成功转染细胞株。MTT结果显示，48、72、96 h时实验组中存活的细胞数低于对照组，差异有统计学意义 （P ＜ 0.05） ；划痕实验结果显示，实验组细胞迁移率明显低于对照组 （P ＜ 0.01） ；transwell小室实验结果显示，实验组中细胞侵袭个数明显低于对照组 （P ＜ 0.01） ；蛋白印迹结果显示，相对于对照组，实验组细胞中p-Akt、p-PI3K及S100A4的表达量随着HBXIP基因沉默而相对降低。结论HBXIP可促进腺样囊性癌细胞株ACC-2增殖、迁移和侵袭，其机制可能与促进Akt、PI3K磷酸化及增加S100A4蛋白表达量有关。

乙肝病毒X蛋白结合蛋白； 腺样囊性癌细胞株ACC-2； 唾液腺； 生物学功能； PI3K/Akt信号通路

腺样囊性癌 （adenoid cystic carcinoma，ACC） 是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一，约占所有唾液腺恶性肿瘤的22%［1］，早期即侵犯神经和血管，容易发生远处肺部转移［2］。目前ACC的治疗多采用手术联合放化疗，但效果不佳。乙肝病毒X蛋白结合蛋白 （hepatitis B X-interacting protein，HBXIP） 通过与乙肝病毒X （hepatitis B-virus X，HBX） 蛋白C末端特异性结合降低其活性，从而影响乙肝病毒的复制周期［3-4］。HBX蛋白被认为是一种多功能癌蛋白，既可以激活信号转导通路，又可以直接作用于细胞转录因子，抑制肝癌细胞凋亡［5］。研究［6］发现，在唾液腺恶性肿瘤细胞中，HBX的表达水平升高，乙型肝炎病毒与唾液腺恶性肿瘤存在相关性。目前尚无文献报道HBXIP与唾液腺ACC的相关性，因此，本研究拟探讨HBXIP对唾液腺ACC细胞株ACC-2［7］增殖、迁移和侵袭功能的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

真核表达载体HBXIP-siRNA由沈阳万类科技有限公司构建，ACC-2细胞株购自武汉大学细胞保藏中心。主要试剂：DMEM培养基 （美国Gibco公司） ，胎牛血清 （美国Hyclone公司） ，Super M-MLV反转录酶 （中国BioTeke公司） ，RNA simple Total RNA Kit和总RNA提取试剂盒 （中国TIANGEN公司） ，MTT试剂 （美国Sigma公司） ，NP-40裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PMSF （中国碧云天生物技术有限公司） ，ECL发光液 （中国七海复泰生物科技有限公司） 和脂质体2000 （美国Invitrogen公司） 。

引物设计：针对HBXIP的核酸序列 （NM_006402）设计引物，HBXIP-F，GGAGCAGCACTTGGAAGACA；HBXIP-R，TCAGTGGGGTCAGAGGTTAG。β-actin-F，CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG；β-actin-R，CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT。引物均由沈阳万类科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞株的培养及传代：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养ACC-2细胞，在37 ℃、5%CO2条件下培养，细胞生长至90%融合时传代，接种密度为1∶3，每2 d传代1次，最后接种于T25培养瓶中（4×105/瓶） ，待细胞密度达90%，收集细胞。

1.2.2 细胞分组及处理：将ACC-2细胞随机分为实验组 （瞬时转染HBXIP-siRNA质粒） ，阴性对照组（转染无意义序列，NC组） 和未转染组 （空白细胞） ，后2组为对照组。转染方法参照Lipofectamine2000说明书，转染前24 h将细胞传代，待细胞密度至50%～60%，更换为无血清的基础培养基处理1 h后进行转染。应用电镜及免疫荧光方法检测细胞是否转染成功。转染48 h后分别收集6孔培养板中各组细胞，进行基因和蛋白的检测。

1.2.3 反转录PCR：用Trizol法分别提取3组细胞的总RNA，用SuperM-MLV反转录酶合成cDNA第一链，以此为模板进行PCR反应。取PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，Gold View染料混匀染色，利用凝胶成像系统拍照。实验重复3次，Quantity One软件分析电泳条带灰度，比较3组细胞中HBXIP mRNA和蛋白的表达情况。

1.2.4 MTT实验：转染24 h后，计数3组细胞并接种于96孔培养板中 （2×103/孔） 。每组设计5个复孔，同时加入调零孔 （只加培养基、MTT、DMSO） 。置于37℃、5% CO2培养箱中分别培养24、48、72、96 h后，加入0.2 mg/mL MTT，置于37 ℃培养箱中孵育4 h，弃上清，加入200 μ L DMSO，在酶标仪上测定其在490 nm处OD值。重复5次，取平均值。

1.2.5 划痕实验：细胞转染24 h后，计数3组细胞并接种于6孔培养板中 （2×103/孔） 。每组设3个复孔，200 μ L枪头垂直划痕，加入无血清培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中培养16 h。于划痕前（ 0 h） 和划痕后16 h分别照相、测距，重复3次，取平均值。

1.2.6 transwell小室实验：转染24 h后，计数实验组（转染组） 和对照组（ NC组，未转染组） 细胞，用无血清培养液1∶10稀释，24孔板的transwell小室每个孔铺100 μ L胶，加入100 μ L细胞悬液，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，擦去膜上层细胞，将膜取下并进行检测。实验重复5次，取平均值。

1.2.7 Western blotting：向3组细胞中加入相应体积的NP-40裂解液，吹散至单细胞悬液，置于冰上静置5 min，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，收集上清行定量分析。取40 μ g总蛋白行10%SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，室温培育2 h。加入一抗，4 ℃培育过夜，TTBS洗膜，分别加入驴抗山羊IgG-HRP（ HBXIP） 和羊抗兔IgG-HRP（ Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K及S100A4） ，37 ℃孵 育45 min，TTBS洗膜，应用增强型ECL显色剂，试剂盒于暗室曝光显影，实验均重复3次，扫描胶片，用凝胶图像处理系统（ Gel-Pro-Analyzer软件） 分析目标条带的光密度值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件进行分析，数据以x-±s表示，组间比较采用Student’s-t检验，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组细胞中HBXIP的表达

细胞成功转染48 h后，实时PCR和Western blotting结果显示，3组细胞中均可检测到HBXIP mRNA和蛋白表达，且实验组表达水平较对照组明显下降，差异有统计学意义 （P ＜ 0.01） ，见图1、2。

图1 实时PCR检测3组中HBXIP基因的表达Fig.1 Expression of the HBXIP gene in experimental and control groups measured via RT-PCR

图2 蛋白印迹法检测3组HBXIP蛋白的表达Fig.2 Expression of HBXIP protein in experimental and control groups measured via Western blotting

2.2 siRNA-HBXIP对ACC-2细胞增殖的影响

MTT结果显示，转染24、48、72、96 h后，实验组OD值 （0.355±0.062，0.697±0.071，1.020±0.111，1.086±0.122） 低于未转染组 （0.402±0.068，0.907±0.112，1.354±0.138，1.414±0.144） 和 NC 组 （0.407±0.046，0.893±0.092，1.313±0.133，1.363±0.143） 。 在这4个时间点，实验组细胞增殖率 （100.000±17.359，196.282±19.914，287.211±31.313，305.915±34.506）较对照组降低，在48、72、96 h时差异有统计学意义（P ＜ 0.05） ，见图3。

图3 MTT法检测3组细胞的增殖情况Fig.3 Proliferation of cells in the experimental and control groups measured via MTT method

2.3 siRNA-HBXIP对ACC-2迁移的影响

划痕实验结果显示，划痕后16 h，实验组、NC组和未转染组细胞迁移率分别为 17.00%±2.00%，30.72%±3.37%，33.01%±3.93%，差异有统计学意义 （P ＜ 0.01） ，见图4、5。

图4 划痕实验法检测16 h时3组细胞的迁移率Fig.4 Migration rate of cells in the experimental and control groups over 16 h measured via the scratch test

2.4 siRNA-HBXIP对ACC-2侵袭能力的影响

transwell检测结果提示，观察24 h后，实验组、NC组、未转染组细胞侵袭数分别为45.00±4.64，81.00±9.03，83.60±8.35，差异有统计学意义 （P ＜0.01）。

2.5 siRNA-HBXIP对PI3K/Akt通路的影响

Western blotting结果显示，HBXIP基因沉默后，实验组HBXIP蛋白的相对表达量 （0.30±0.04） 明显低于NC组 （0.97±0.02） 和未转染组 （1.00±0.01）。HBXIP 基因沉默后，实验组中 p-Akt、 p-PI3K和S100A4蛋白的表达降低 （0.64±0.02，0.40±0.01，0.64±0.02） ，差异有统计学意义 （P ＜ 0.05） ，见图6。

图5 光镜下实验组及对照组迁移情况的比较 ×100Fig.5 Comparison of cell migration patterns between the experimental and control groups under the microscope ×100

图6 Western blotting法检测3组细胞中p-Akt、Akt、p-PI3K、PI3K及S100A4蛋白的表达情况Fig.6 Expression of p-Akt，Akt，p-PI3K，PI3K and S100A4 protein in the three groups measured via Western blotting

3 讨论

癌基因蛋白HBXIP是一种调节蛋白，可在动物肌肉组织以及恶性肿瘤组织中过表达。近年来，也有研究［5］发现它能与人体多种蛋白结合。在唾液腺恶性肿瘤细胞中可检测到HBX的表达，表达阳性率高于对照组，提示乙型肝炎病毒与唾液腺恶性肿瘤存在相关性［7］。HBXIP还可促进乳腺癌细胞和肝癌细胞的增殖及迁移［8-11］，也能够刺激Skp2基因启动子的活性，并通过转录因子Sp1促进卵巢癌细胞迁移［12］。最新研究［13］发现，HBXIP过度表达与宫颈癌进展有关联，并可能作为早期诊断宫颈癌的生物标志物。

PI3K/Akt信号通路是新发现的一条酪氨酸激酶级联信号通路，是国内外学者公认的癌细胞存活的重要通路，在恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。该信号通路可以在多种恶性肿瘤中过度活化［14］。有研究［15］发现HBXIP能诱导HepG2细胞增殖，激活PI3K/Akt信号通路。LIU等［16］发现过表达HBXIP可激活PI3K/Akt通路，HBXIP可能通过PI3K/Akt通路间接促进S100A4的表达，从而促进乳腺癌细胞的生长和迁移。也有研究［17］发现，HBXIP可下调PCK1的表达，通过下调肝癌细胞转录因子FOXO1和上调miR-135a，抑制靶向细胞中FOXO1 mRNA的3’UTR端，通过激活PI3K/Akt通路FOXO1蛋白的磷酸化水平，导致该蛋白从细胞核向细胞质转移。

本研究组在前期实验中对ACC细胞ACC-2中HBXIP蛋白的表达情况进行了检测，发现其在ACC-2中有较多表达，为进一步阐明HBXIP对ACC细胞株ACC-2的影响，选择对HBXIP基因沉默，并研究其对ACC-2增殖、迁移和侵袭以及PI3K/Akt信号通路的影响。

RNA干涉 （RNA intergerence，RNAi） 是指在进化过程中高度保守的、双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，它能诱导序列特异的目标基因沉默，是由FIRE等［18］于1998年发现的迄今最有效的封闭基因表达方法之一。siRNA是RNAi途径的中间产物，在RNA沉默通路中起核心作用，因此，本研究中构建了siRNA-HBXIP真核表达载体。本研究结果显示，HBXIP基因沉默能够抑制ACC细胞株ACC-2的增殖、迁移和侵袭，并有可能是通过抑制S100A4蛋白的表达及PI3K和Akt磷酸化来实现的。本研究中所用HBXIP抑制剂有可能成为有效的化疗药物，其可能的机制是通过下调PI3K/Akt信号通路PI3K和Akt靶点蛋白的磷酸化和S100A4的蛋白表达，从而抑制唾液腺细胞的恶性转化，同时抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。

总之，HBXIP可能通过激活PI3K/AKT信号通路关键蛋白，在ACC细胞株ACC-2的增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用，有关具体途径和机制有待进一步研究。

［1］ BRADLEY PJ. Adenoid cystic carcinoma of the head and neck：a review［ J］. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg，2004，12（ 2） ：127-132. DOI：10.1097/MOO.0000000000000347.

［2］ TIAN Z，LI L，WANG L，et al. Salivary gland neoplasms in oral and maxillofacial regions：a 23-year retrospective study of 6982 cases in an eastern Chinese population［ J］. Int J Oral Maxillofac Surg，2010，39（ 3） ：235-242. DOI：10.1016/j.ijom.2009.10.016.

［3］ MELEGARI M，SCAGLIONI PP，WANDS JR. Cloning and characterization of a novel hepatitis B virus x binding protein that inhibits viral replication［ J］. J Virol，1998，72（ 3） ：1737-1743.

［4］ 刘剑平，申杰，蓝文贤，等. 乙肝病毒X蛋白结合蛋白最新研究进展［J］. 基因组学与应用生物学，2012，31（ 2） ：192-196. DOI：10.3969/gab.031.000192.

［5］ KIM KH. Pro-apoptotic function of hepatitis B virus X protein［J］. Korean J Hepatol，2010，16（ 2） ：112-122. DOI：10.3350/kjhep.2010.16.2.112.

［6］ 谢玲. HBX蛋白在涎腺恶性肿瘤中表达的相关性研究［D］ . 昆明：昆明医科大学口腔医学院，2012.

［7］ 何荣根，张晓珊，周晓健，等. 涎腺腺样囊性癌ACC-2和ACC-3细胞系的建立及其形态学观察［J］. 华西口腔医学杂志，1988，6（ 1） ：1-3.

［8］ LI H，LIU Q，WANG Z，et al. The oncoprotein HBXIP modulates the feedback loop of MDM2/p53 to enhance the growth of breast cancer［J］. J Biol Chem，2015，290（ 37） ：22649-22661. DOI：10.1074/jbc.M115.658468.

［9］ LIU F，ZHANG W，YOU X，et al. The oncoprotein HBXIP promotes glucose metabolism reprogramming via downregulating SCO2 andPDHA1 in breast cancer［ J］. Oncotarget，2015，6（ 29） ：27199-27213.DOI：10.18632/oncotarget.4508.

［10］ WANG Y，FANG R，CUI M，et al. The oncoprotein HBXIP up-regulates YAP through activation of transcription factor c-Myb to promote growth of liver cancer［ J］. Cancer Lett，2017，385：234-242. DOI：10.1016/j.canlet.2016.10.018.

［11］ LI L，LIU B，ZHANG X，et al. The oncoprotein HBXIP promotes migration of breast cancer cells via GCN5-mediated microtubule acetylation［ J］. Biochem Biophys Res Commun，2015，458（ 3） ：720-725. DOI：10.1016/j.bbrc.2015.02.036.

［12］ XU F，ZHU X，HAN T，et al. The oncoprotein hepatitis B X-interacting protein promotes the migration of ovarian cancer cells through the upregulation of S-phase kinase-associated protein 2 by Sp1［J］.Int J Oncol，2014，45（ 1） ：255-263. DOI：10.3892/ijo.2014.2411.

［13］ LI N，WANG Y，CHE S，et al. HBXIP over expression as an independent biomarker for cervical cancer［ J］. Exp Mol Pathol，2017，102（ 1） ：133-137. DOI：10.1016/j.yexmp.2017.01.009.

［14］ MICHL P，DOWNWARD J. Mechanisms of disease：PI3K/AKT signa-ling in gastrointestinal cancers［ J］. Z Gastroenterol，2005，43（10）：1133-1139. DOI：10.1055/s-2005-858638.

［15］ WANG FZ，FEI HR，LIAN LH，et al. Hepatitis B X-interacting protein induces HepG2 cell proliferation through activation of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway［ J］. Exp Biol Med（ Maywood），2011，236（ 1） ：62-69. DOI：10.1258/ebm.2010.010179.

［16］ LIU S，LI L，ZHANG Y，et al. The concoprotein HBXIP uses two pathways to up-regulate S100A4 in promotion of growth and migration of breast cancer cells［ J］. J Biol Chem，2012，287（ 36） ：30228-30239. DOI：10.1074/jbc.M112.343947.

［17］ SHI H，FANG R，LI Y，et al. The oncoprotein HBXIP suppresses gluconeogenesis through modulating PCK1 to enhance the growth of hepatoma cells［ J］. Cancer Lett，2016，382（ 2） ：147-156. DOI：10.1016/j.canlet.2016.08.025.

［18］ FIRE A，XU S，MONTGOMERY MK，et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans［ J］. Nature，1998，391（ 6669） ：411-417. DOI：10.1016/j.jconrel.2012.12.023.

Effect of HBXIP Expression on the Biological Behavior of the Adenoid Cystic Carcinoma Cell Line ACC-2

MENG Xue1，QI Xiaoyu2，LIU Weixian1，WANG Yao3，WANG Qiuxu1
（1. Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China； 2. Department of Stomatology，Liaoning Province Tiefa Coal Group General Hospital，Tieling 112000，China； 3. Teaching & Research Section of Preventive Veterinary Medicine，College of Animal Science & Veterinary Medicine，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

ObjectiveTo study the effect of hepatitis B virus X-interacting protein （HBXIP） on the proliferation，migration，and invasion of ACC-2 cells，and the possible mechanism of the PI3K/Akt signaling pathway involved.MethodsThe chemically synthesized HBXIP-siRNA plasmid was transfected into the ACC-2 cells. RT-PCR and Western blotting were performed to detect the expression of HBXIP in the ACC-2 cells. Cell proliferation was measured via MTT assay. The invasive and migratory abilities of the ACC-2 cells were evaluated via the transwell chamber assay and scratch test，respectively. Western blotting also detected the impact of HBXIP-siRNA on Akt，p-Akt，PI3K，p-PI3K，and S100A4 protein expression.ResultsHBXIP was highly expressed and HBXIP-siRNA was successfully transfected in ACC-2 cells. MTT results showed that the number of surviving cells in the experimental group was significantly lower than that in the control group （P ＜ 0.05） . The scratch test results showed that the mobility of the experimental group was significantly lower than that of the control group （P ＜ 0.01） . The transwell assay showed that the rate of cell invasion of the experimental group was significantly lower than that of the control group （P ＜ 0.01） . Finally，Western blotting results revealed that the expression of p-Akt，p-PI3K，and S100A4 was relatively decreased in the experimental group when compared to that in the control group.ConclusionSilencing the HBXIP gene inhibited ACC-2 proliferation，invasion，and migration.

hepatitis B X-interacting protein； ACC-2 cell line； salivary gland； biological functions； PI3K/Akt signaling pathway

R782.7

A

0258-4646 （2017） 12-1082-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20171130.1805.012.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.12.006

辽宁省科学技术计划 （2011010215-404）

孟雪 （1986-） ，女，医师，硕士.

王秋旭，E-mail：wangqx@sj-hospital.org

2017-03-31

网络出版时间：2017-11-30 18:05

（编辑 王又冬）