响应面法优化黄芪下脚料蛋白提取工艺

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(中国药科大学工学院,江苏南京 211198)

响应面法优化黄芪下脚料蛋白提取工艺

黄浩,秦高一鑫,陈贵堂*,綦国红,程抒劼,杨志萍

(中国药科大学工学院,江苏南京 211198)

为确定黄芪下脚料蛋白的最佳提取工艺,有利于其进一步的活性研究,为其资源开发利用提供科学依据,使其变废为宝。通过单因素实验考察了提取温度、料液比、pH、提取时间和提取次数对黄芪下脚料蛋白提取率的影响,并通过响应面法优化了提取条件。结果表明,凯氏定氮法测得黄芪下脚料中蛋白含量为10.74%±0.13%,蛋白最佳提取工艺为提取温度64 ℃、液料比47∶1 (mL·g-1)、pH12.0、提取时间4.3 h,提取2次,在此条件下,提取率的理论最大值为46.96%,实验验证值为47.03%±0.78%,采用响应面法优化得到黄芪下脚料蛋白提取工艺的参数准确可靠,该回归模型具有较好的预测性能,可用于指导生产实践,为黄芪下脚料蛋白的工业化生产提供一定的技术参考。

黄芪下脚料,蛋白,碱提酸沉法,响应面法

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. Var. monghoicus(Bge.)Hsiao 或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]。现代医学证明它具有降压、利尿、强心、抗菌、抗肿瘤等药理作用[2]。黄芪中含有多达25种氨基酸[3],氨基酸含量为8.05%[4],说明黄芪中蛋白含量较为丰富。此外,黄芪蛋白还具有较强的免疫抑制[5-6]和抗氧化活性[7]。黄芪是大宗药材,每年炮制黄芪饮片时会产生大量的碎粒和碎末,即黄芪下脚料,因此开发黄芪下脚料蛋白资源具有重要的研究意义。

蛋白提取的主要方法有碱提酸沉法、酶法提取、物理提取法等。酶法提取的反应条件温和,不会产生有害物质,能更多地保留蛋白质的营养价值,但由于蛋白酶价格昂贵、生产成本高,限制了蛋白酶法的产业化应用[8]。常用的物理提取法包括微波、超声波、反复冻融和高速剪切等。物理法提取的蛋白质不经过化学反应,保持了蛋白质原有的结构和营养价值,但存在设备投资较高、提取率较低等缺点[9]。工业上大多采用碱提酸沉法来制备蛋白,碱提酸沉法制备的蛋白具有较好的起泡性、泡沫稳定性、持水性和持油性等功能特性,更适合用于食品加工中[10]。蛋白质组分间存在较强的聚结作用和广泛的二硫键交联,给提取带来一定困难,高浓度碱可以水解蛋白组分间的氢键、酰胺键、二硫键,从而释放更多的蛋白质[11-12]。此外,碱提酸沉法还具有提取率高、成本低的优点,其缺点主要是提取过程中使用大量的酸碱,给分离纯化带来一定困难。响应面法采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系,通过对回归方程分析来寻求最优条件,已广泛用于蛋白提取工艺的优化[13-16]。因此本实验采用碱提酸沉法,利用响应面法优化黄芪下脚料蛋白的提取工艺,可为黄芪下脚料蛋白的后续研究奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本实验采用的黄芪下脚料均为同一批次产品,购于安徽亳州,产自甘肃岷县,是黄芪药材根部在进行产地初加工时被切药机制成黄芪饮片后经4目筛分出的碎粒和碎末。用超微粉碎机粉碎后经300目筛分,制成黄芪下脚料超微粉。

牛血清白蛋白(LR) Roche公司;考马斯亮蓝G-250(AR) 国药集团化学试剂有限公司;氢氧化钠(AR) 西陇化工股份有限公司;盐酸、磷酸(AR) 南京化学试剂股份有限公司;无水乙醇(AR) 无锡市亚盛化工有限公司。

HH-42数显恒温搅拌循环水箱 常州国华电器有限公司;PHS-3B型pH计 上海雷磁仪器厂;WFJ-15型超微粉碎机 江阴市百华粉体工程机械有限公司;KDN-08D凯氏定氮仪 上海新嘉电子有限公司;TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;LXJ-ⅡB型低速大容量多管离心机 上海安亭科学仪器厂;JJ-1A数显测速电动搅拌器 金坛市白塔新宝仪器厂;ATX224型分析天平 岛津(香港)有限公司;FD-1C-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄芪下脚料蛋白提取的一般工艺 精确称取一定量黄芪下脚料超微粉,加入一定料液比的蒸馏水,用1 mol·L-1的氢氧化钠调节pH,在一定温度条件下恒温搅拌浸提一定时间,其中每隔30 min调节一次pH,维持提取液pH稳定。4000 r·min-1离心15 min得上清液,用1 mol·L-1的盐酸调节上清液的pH至黄芪下脚料蛋白的等电点,待蛋白质以絮状沉淀到杯底后,放入冰箱中冷藏静置过夜,使蛋白质进一步沉淀。4000 r·min-1离心10 min,收集沉淀,用95%乙醇洗涤沉淀,至离心(4000 r·min-1、10 min)后上清液颜色为无色[17],冷冻干燥,即得黄芪下脚料蛋白成品。

1.2.2 单因素实验 分别考察料液比、提取温度、pH、提取时间和提取次数对蛋白提取率的影响,每组实验重复3次,取平均值。

1.2.2.1 液料比对黄芪下脚料蛋白提取率的影响 在固定提取温度60 ℃、pH9.0、提取时间3 h的条件下搅拌提取一次,考察不同液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 mL·g-1)对黄芪下脚料蛋白提取率的影响。

1.2.2.2 提取温度对黄芪下脚料蛋白提取率的影响 在固定料液比50∶1 (mL·g-1)、pH9.0、提取时间3 h的条件下搅拌提取一次,考察不同提取温度(30、40、50、60、70、80 ℃)对黄芪下脚料蛋白提取率的影响。

1.2.2.3 pH对黄芪下脚料蛋白提取率的影响 在固定提取温度60 ℃、液料比50∶1 (mL·g-1)、提取时间3 h的条件下搅拌提取一次,考察不同pH(8、9、10、11、12、13)对黄芪下脚料蛋白提取率的影响。

1.2.2.4 提取时间对黄芪下脚料蛋白提取率的影响 在固定提取温度60 ℃、液料比50∶1 (mL·g-1)、pH12的条件下搅拌提取一次,考察不同提取时间(1、2、3、4、5、6 h)对黄芪下脚料蛋白提取率的影响。

1.2.2.5 提取次数对黄芪下脚料蛋白提取率的影响 在固定提取温度60 ℃、液料比50∶1 (mL·g-1)、pH12、提取时间4 h的条件下,考察不同提取次数(1、2、3次)对黄芪下脚料蛋白提取率的影响[18]。

1.2.3 响应曲面实验设计 根据Box-Behnken原理设计实验,结合上述单因素影响实验结果,选取提取温度、液料比、pH、提取时间4个影响因素,以蛋白提取率为考察指标,在单因素实验的基础上,确定响应面实验的因素和水平,见表1,每个因素低、中、高水平分别以-1、0、1进行编码[19]。

表1 Box-Behnken实验因素水平表Table 1 Level of experimental factors in Box-Behnken design

1.3 分析方法

1.3.1 黄芪下脚料中蛋白含量测定 参照GB 5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》(凯氏定氮法)[20],测定出黄芪下脚料中蛋白质的含量为10.74%±0.13%。

1.3.2 标准曲线的制作 标准蛋白溶液:精确称取一定量牛血清白蛋白,配成120 μg·mL-1。考马斯亮蓝G-250溶液:精确称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50 mL 95%乙醇中,加入100 mL 85%(w·v-1)的磷酸,用蒸馏水定容到1000 mL棕色容量瓶中,贮存在棕色瓶中于4 ℃下避光保存[21]。取6支具塞试管并编号1、2、3、4、5、6,各加入0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL牛血清白蛋白标准溶液,2至6号试管用蒸馏水补足至1.0 mL,1号试管加入2 mL蒸馏水。2至6号试管各加入5 mL考马斯亮蓝G-250溶液,1号试管加入10 mL考马斯亮蓝G-250溶液,振荡摇匀3 min,于595 nm处,以1号试管中的溶液作参比,测定紫外吸光度。以牛血清白蛋白含量(μg·mL-1)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程y=0.0061x+0.0234,R2=0.9991。

1.3.3 黄芪下脚料蛋白等电点测定 精确称取10.000 g黄芪下脚料超微粉,按40∶1 (mL·g-1)的料液比加入蒸馏水,调pH至12.0,在70 ℃的恒温水浴箱中搅拌提取4 h。离心(4000 r·min-1、15 min),分别取上清液9份各20 mL,用1 mol·L-1的盐酸调pH至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,静置1 h,离心(4000 r·min-1、10 min),将上清液定容至50 mL,通过考马斯亮蓝染料比色法于 595 nm波长下测紫外吸光度,根据标准曲线计算上清液中蛋白质的质量,利用公式(1)计算黄芪下脚料蛋白的沉淀率,上清液中蛋白沉淀率最大值对应的pH即为黄芪下脚料蛋白的等电点。[22]

沉淀率(%)=(酸沉淀前上清液中蛋白质的质量-酸沉淀后上清液中蛋白质的质量)/酸沉淀前上清液中蛋白质的质量×100

式(1)

1.3.4 蛋白提取率的测定 蛋白提取率(%)=提取液中的蛋白质量(g)/原料中的蛋白质量(g)×100。提取液中的蛋白质量通过考马斯亮蓝染料比色法测定[23],原料中的蛋白质量采用凯氏定氮法测定[20]。

1.3.5 数据统计分析 每个样品重复测定3次,用Microsoft Office Excel 2007数据处理软件求出平均值和标准误差,数据用均值±标准偏差(x±s)表示。利用Designexpert 8.0.5.0软件进行响应面数据分析和SPSS 22.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 黄芪下脚料蛋白等电点测定

由图1可知,黄芪下脚料蛋白的沉淀率随着pH的升高而上升,在达到pH3.5后显著下降。故黄芪下脚料蛋白在pH3.5时沉淀率达到最大值,此时其蛋白溶解度最小,也就是它的等电点。

图1 黄芪下脚料蛋白等电点测定Fig.1 Isoelectric point of protein from Astragali radix waste

2.2 单因素实验

2.2.1 料液比对黄芪下脚料蛋白提取率的影响 图2结果表明,提取率随着料液比的增加而增加,可能是因为料液比较小时,提取体系的黏度过大,不利于物料扩散,导致蛋白质溶出速率小,随着料液比的增加,黄芪下脚料与提取液接触面积越大,蛋白不断溶出。当液料比为50∶1 (mL·g-1)时,提取率达到最大,液料比继续增加,提取率基本不变。说明在液料比在50∶1 (mL·g-1)时,蛋白已充分溶解出来,故选较优液料比为50∶1 (mL·g-1)。

图2 液料比对黄芪下脚料蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of solvent/solid ratio on the extraction rate of protein from Astragali radix waste

2.2.2 提取温度对黄芪下脚料蛋白提取率的影响 从图3可以看出,提取温度在30～60 ℃之间,黄芪下脚料蛋白提取率随着提取温度的升高而升高,当提取温度大于60 ℃后,提取率有略微的下降。可能随着提取温度升高,溶液的黏度降低,蛋白分子的热运动开始加强,分子间的相互作用减弱[18],使得蛋白溶解度增加,蛋白提取率提高,温度60 ℃时提取率达到最高,所以最佳提取温度为60 ℃。

图3 提取温度对黄芪下脚料蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of protein from Astragali radix waste

2.2.3 pH对黄芪下脚料蛋白提取率的影响 从图4结果可以看出,在pH为8～12的范围内,提取率随着pH的增大而增大,可能是因为在较低的碱性环境中,黄芪下脚料蛋白和水的结合能力增加,蛋白的溶解度增加。在pH为12时,提取率达最大,此时蛋白溶解较充分,继续升高pH,提取率不再增加,故而选择较优pH为12。

图4 pH对黄芪下脚料蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of pH on the extraction rate of protein from Astragali radix waste

2.2.4 提取时间对黄芪下脚料蛋白提取率的影响 图5结果表明,提取率随着提取时间的延长而增加,当提取时间超过4 h后,提取率增幅变缓,可能是随着时间的延长,蛋白能够充分的溶解,提取一定时间后,蛋白的溶解基本达到最大,再延长时间也无法溶解更多蛋白,故而较优的提取时间为4 h。

图5 提取时间对黄芪下脚料蛋白提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on the extraction rate of protein from Astragali radix waste

2.2.5 提取次数对黄芪下脚料蛋白提取率的影响 对该实验结果进行单因素方差分析,结果表明,提取1次和提取2次对提取率的影响有显著性差异,提取2次和提取3次对提取率的影响无显著性差异。从图6中可看出,提取2次比提取1次的提取率显著增加,提取2次之后,继续增加提取次数,提取率基本不再增加,故而,较优提取次数为提取2次。

图6 提取次数对黄芪下脚料蛋白提取率的影响Fig.6 Effect of extraction times on the extraction rate of protein from Astragali radix waste注：a表示有显著性差异，b表示无显著性差异。

2.3 响应面法优化提取条件

2.3.1 响应面实验设计及结果 利用Design-Expert 8.0.5.0软件对表2数据进行多元回归拟合,得到蛋白提取率(Y)对温度(A)、料液比(B)、pH(C)和时间(D)四个因素的二次多项回归模型为:Y=45.74+2.20A-2.01B+2.76C+1.71D-0.98AB-1.62AC+0.81AD+0.40BC+1.68BD-2.28CD-3.38A2-3.00B2-3.42C2-1.75D2

表2 实验设计及结果Table 2 Box-Behnken design and results

对上述模型进行方差分析,结果见表3。由表3可知,该模型达到极显著水平(p<0.01),失拟项不显著(p>0.05),并且该模型的决定系数R2=0.9574,校正决定系数R2=0.9148,说明建立的模型能够解释91.48%响应值的变化,回归方程的拟合度很高,可以用此模型来分析和预测碱法提取黄芪下脚料蛋白的工艺结果。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

注:**差异极显著(p<0.01);*差异显著(p<0.05)。

方差分析结果还表明,回归方程的一次项A、B、C、D影响极显著(p<0.01),交互项AC和BD影响显著(p<0.05),CD影响极显著(p<0.01),平方项均达到极显著水平(p<0.01),由此可见,提取温度、料液比、pH和提取时间对黄芪下脚料蛋白的提取率都有极显著的影响。方差分析中各因素的F值可以反映各因素对于实验指标的影响大小,F越大,影响效果越大[24]。从表3可知,FC(66.23)>FA(41.79)>FB(35.19)>FD(25.29),因此,各因素对黄芪下脚料蛋白提取率的影响依次是pH>提取温度>料液比>提取时间。

2.3.2 两因素间的交互效应分析 为了进一步考察4个实验因素的交互作用,利用Design Expert 8.0.5.0 软件绘制出响应面图来进行分析。响应面图可以直观地看出两变量交互作用的显著程度。如果一个响应曲面坡度相对平缓,表示其对响应值影响不大,相反,如果一个响应曲面坡度比较陡峭,表示其对响应值影响较大[25]。图7中等高线沿pH轴向较提取温度轴向密集,说明pH对蛋白提取率的影响较提取温度大,等高线中心点为两者的最优值,表3中,提取温度与pH交互作用p=0.0154<0.05,并且图7中响应曲面坡度比较陡峭,说明提取温度与pH对蛋白提取率有显著影响。图8中,等高线沿料液比轴向较提取时间轴向密集,说明料液比对蛋白提取率的影响较提取时间大,等高线中心点为两者的最优值,表3中,液料比与提取时间交互作用p=0.0129<0.05,并且图8中响应曲面坡度比较陡峭,说明料液比与提取时间对蛋白提取率有显著影响。图9中,等高线沿pH轴向较提取时间轴向密集,说明pH对蛋白提取率的影响较提取时间大,等高线中心点为两者的最优值,表3中,pH与提取时间交互作用p=0.0017<0.01,并且图9中响应曲面坡度陡峭,说明pH与提取时间对蛋白提取率有极显著影响。

图7 提取温度与pH对黄芪下脚料蛋白提取率影响的响应面与等高线Fig.7 Response surface and contour plot showing the effect of extraction temperature and pH on the extraction rate of protein from Astragali radix waste

图8 料液比与提取时间对黄芪下脚料蛋白提取率影响的响应面与等高线Fig.8 Response surface and contour plot showing the effect of solvent/solid ratio and extraction time on the extraction rate of protein from Astragali radix waste

图9 pH与提取时间对黄芪下脚料蛋白提取率影响的响应面与等高线Fig.9 Response surface and contour plot showing the effect of pH and extraction time on the extraction rate of protein from Astragali radix waste

2.3.3 最佳条件优化及验证结果 利用Design Expert 8.0.5.0软件对实验模型进行分析,得到最佳提取工艺条件为提取温度63.54 ℃、液料比47.03∶1 (mL·g-1)、pH12.20、提取时间4.29 h,在此条件下提取2次,黄芪下脚料蛋白提取率的最大理论值为46.96%。考虑实际操作情况,确定黄芪下脚料蛋白的最佳提取工艺为提取温度64 ℃、料液比47∶1 (mL·g-1)、pH12.0、提取时间4.3 h,提取2次。为了确定建立的模型与实验结果是否相符,进行3组平行实验,实测平均提取率为47.03%±0.78%,表明该回归模型具有较好的预测性能,可用于指导生产实践。

3 结论

凯氏定氮法测得黄芪下脚料的蛋白含量为10.74%±0.13%,蛋白质含量较为丰富,具有较大的开发利用前景。优化得到黄芪下脚料蛋白的最佳提取工艺条件为:提取温度64 ℃、料液比为47∶1 (mL·g-1)、pH12.0、提取时间4.3 h,提取2次,提取率的理论最大值为46.96%,实测平均提取率为47.03±0.78%,表明该模型具有较好的预测性能。本研究系统地研究了黄芪下脚料蛋白的提取工艺,得出的最优提取条件可用于指导生产实践,为工业化生产黄芪下脚料蛋白及其后续的研究奠定一定的基础,实现黄芪下脚料的废物再利用。

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OptimizationofproteinextractionfromAstragaliradixwastebyresponsesurfacemethodology

HUANGHao,QINGao-yi-xin,CHENGui-Tang*,QIGuo-hong,CHENGShu-jie,YANGZhi-ping

(College of Engineering,China Pharmaceutical University,Nanjing 211198,China)

In order to further research on its activity and providing scientific basis for its resource development and utilization,we determine the best extraction technology ofAstragaliradixwaste protein,making waste into treasure ofAstragaliradixwaste. The effects of extraction temperature,solvent/solid ratio,pH,extraction time and extraction times on the extraction rate ofAstragaliradixwaste were investigated by single factor test. In addition,the extraction conditions were optimized by response surface methodology. Results showed that the protein content ofAstragaliradixwaste was 10.74%±0.13% by kjeldahl method. The optimal extraction conditions ofAstragaliradixwaste protein were as follows:the extraction temperature was 64 ℃,the solvent/solid ratio was 47∶1 (mL·g-1),pH was 12.0 and extraction time was 4.3 h. Under this condition,the theoretical maximum of extraction rate was 46.96%,and the experimental value was 47.03%±0.78%. The extraction condition ofAstragaliradixwaste protein optimized by response surface methodology was accurate and reliable and the regression model has good predictive performance,which can guide the production practice and provide some technical reference for industrial production ofAstragaliradixwaste protein.

Astragaliradixwaste;protein;alkali extraction and acid precipitation;response surface methodology

2017-05-08

黄浩(1993-), 男，硕士研究生,研究方向：食品与药物分析，E-mail:huanghao1993@126.com。

*通讯作者:陈贵堂(1977-), 男，博士,副教授，研究方向：营养与功能性食品学，E-mail:caucgt@163.com。

中国药科大学中央高校基本科研业务费重点项目(2016ZZD001)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)23-0170-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.032