我国水产疫苗浸泡免疫研究现状

2017-12-18张美彦张效平商宝娣李正友

水产科学 2017年5期

关键词：佐剂鱼体活疫苗

杨星，张美彦，张效平，商宝娣，李正友

( 贵州省农业科学院水产研究所，贵州贵阳 550025 )

我国水产疫苗浸泡免疫研究现状

杨星，张美彦，张效平，商宝娣，李正友

( 贵州省农业科学院水产研究所，贵州贵阳 550025 )

水产疫苗；浸泡免疫；现状

中国水产养殖产量居世界首位，养殖集约化水平不断提高，养殖水环境却持续恶化，病害频发[1]。目前，主要以抗生素等化学药物防治水产动物的病害，长期使用不仅会增加病原菌的耐药性，降低药效，给鱼病防治增加难度，同时也抑制了鱼体内部有益菌的生存，引起药物在鱼体内富集，导致水产品质量下降，对消费者存在潜在风险[2-3]。我国对鱼类疾病的防控措施主要有药物防控、免疫预防、生态与综合防控等，目前在生产上使用的渔用疾病防治产品不多，特别是渔用疫苗的开发与应用。与传统的药物防治相比，渔用疫苗不仅可以提高鱼类特异性及非特异性免疫水平，增强免疫保护力，还具有无残留、无污染、不易引起耐药性等特点，因此，疫苗的免疫预防是控制水产动物病害较为有效的措施[4-5]。在渔用疫苗免疫操作中，浸泡免疫是最简单的免疫方式，但在浸泡免疫操作中单纯使用疫苗效果不佳，而且目前我国研究开发的新型疫苗抗原纯度较高，特异性强，可免疫原性较差，诱导机体产生的免疫应答较弱，而佐剂的应用可提高其免疫原性，增强机体对抗原的免疫应答，疫苗的浸泡只有选择合适的佐剂配伍才能有效的提高浸泡免疫效果[6-7]。因此，随着鱼类养殖集约化程度越来越高，水产疫苗浸泡免疫的研究和应用及浸泡用疫苗佐剂的开发就显得更加迫切。本文仅对我国水产疫苗浸泡免疫研究现状作一综述。

1 鱼类黏膜免疫机制

鱼类生活在病原微生物较为丰富的水环境中，其皮肤和鳃最先接触病原微生物，这两个部位的黏膜不仅为鱼体提供物理屏障，其局部的特异和非特异性免疫还有杀灭入侵病原的作用[8]。研究水产疫苗浸泡免疫的关键是要弄清鱼类皮肤黏膜和鳃黏膜的免疫机制，这对深入研究水产疫苗浸泡免疫机理和鱼类病害防控具有重要意义。

1.1 鱼类皮肤黏膜免疫机制

鱼类拥有较为发达的非特异性免疫系统，其皮肤黏膜是抵御病原微生物入侵的第一道防线。当皮肤黏膜受到外界刺激后会产生大量黏液，这些黏液除具有物理隔离入侵的病原微生物作用外，其还含有许多抗菌物质，可以有效地保护鱼体免受感染[9]。因此，以鱼类皮肤黏膜为基础研究相关的免疫学，不仅对鱼病的防治有重要的意义，还可为改善疫苗接种途径，优化疫苗制备工艺，提高疫苗免疫保护措施提供科学依据[10]。

鱼体皮肤黏液中主要包含的抗菌物质有抗菌肽、溶菌酶、蛋白酶、碱性磷酸酶和其他抗菌蛋白等，其中，溶菌酶可以有效破坏病原微生物细胞壁上的肽聚糖，是鱼体抵御革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌侵袭的有效抗菌剂[11-13]。碱性磷酸酶是一种溶菌体酶，主要在鱼体伤口愈合前期发挥保护性作用；黏液中的蛋白酶也可为鱼体提供先天性免疫保护[14]。此外，鱼体皮肤黏液中还包含很多重要的先天性免疫因子，如白介素、补体和干扰素等。它们分别在鱼体抵御及杀灭入侵病原微生物过程中发挥重要的免疫调节作用[15-17]。水产疫苗经浸泡免疫后可使鱼体皮肤黏膜系统产生大量的特异性抗体，表明鱼体皮肤黏膜分泌的抗体具有保护机体和防御病原微生物感染的作用[18]。

1.2 鱼类鳃黏膜免疫机制

鱼类的鳃中含有许多淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞等，这些细胞具有产生免疫应答的条件。胞内酶活性检测表明，粒细胞和巨噬细胞具有酸性和碱性磷酸酶活性。鱼体鳃中许多细胞都可分泌趋化物质，可将机体血液中的白细胞趋化至鳃组织内，并长期滞留其中。相关研究也发现，体外培养的鳃受到病原微生物刺激后，其嗜酸性粒细胞数量大量增加。Aaltonen等[19]研究发现，抗原先经上皮细胞摄取后，再转运至鳃部的吞噬细胞进行吞噬。已从鱼类鳃中分离出的抗菌肽具有广谱抗菌活性，对革兰氏阴性和阳性细菌均有作用[20]。经疫苗浸泡免疫后，鱼体鳃中抗体量增加，而血清中抗体量没有变化，这说明鱼类的鳃具备独立进行局部免疫应答的能力[21]。

2 水产疫苗免疫方式

我国研究和开发的渔用疫苗种类较多，但疫苗的推广应用主要取决于其免疫方式的研究和应用程度。目前，渔用疫苗的免疫方式主要有注射、口服、浸泡和喷洒等，其中注射、口服和浸泡免疫在生产中应用较多。

2.1 注射免疫

目前，国内水产疫苗的免疫方式主要为注射免疫，鱼体产生的免疫应答主要为系统免疫应答，不仅可极显著增加血清抗体量，还可以有效控制疫苗接种剂量，避免疫苗浪费，获得的免疫保护效果较好[22-24]；根据接种部位，注射免疫一般分为肌肉注射、腹腔注射和皮下注射，其中腹腔注射免疫是疫苗接种最常用的方法，注射免疫能够确保抗原进入受免鱼体内，适合用于进行相关免疫学研究的试验鱼免疫及集约化规模较小的养殖鱼类的生产免疫。但其需将鱼体从养殖水体中捞出，对受免鱼体造成机械损伤和应激性刺激，不适合在鱼苗和鱼类大规模养殖中推广使用，在一定程度上限制了水产疫苗注射免疫的推广应用[25]。

2.2 浸泡免疫

浸泡免疫指将受免动物置于含有一定含量的疫苗溶液中浸泡一段时间，以达到免疫接种的目的，喷淋免疫是变化形式的浸泡免疫。目前，浸泡免疫接种的疫苗类型主要有灭活疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗等，其中全菌灭活疫苗的浸泡免疫对鱼体的免疫效果较好。由于疫苗制备方法的差异或病原微生物的特殊性，导致其浸泡免疫效果参差不齐。如全菌灭活疫苗的浸泡免疫需在其中加入合适的佐剂才能发挥较好的免疫效果；亚单位疫苗的浸泡免疫需提取准确的免疫原才能发挥较理想的效果，且疫苗纯度要求较高；由于DNA疫苗制备复杂，成本较高，浸泡免疫过程中使用较少[26-28]。浸泡免疫既可以诱导鱼体产生黏膜免疫反应，也可以诱导产生系统免疫反应，其免疫机理为：抗原可刺激皮肤和鳃黏膜组织产生特异性和非特异性免疫应答，且抗原经皮肤和鳃可进一步扩散至脾脏和外周血等系统免疫组织中，刺激机体产生系统免疫应答[29-31]。浸泡免疫主要通过改变浸泡环境渗透压等方法来提高鱼体皮肤和鳃对疫苗的摄入量，其免疫效果受疫苗含量、水温、受免鱼体规格、浸泡时间长短和有无佐剂等的影响，其中，疫苗含量和浸泡时间对其影响最大[32-34]。目前，针对水产疫苗浸泡免疫效果不理想的情况，可配伍佐剂一起使用来提高鱼类的浸泡免疫效果[35-37]。佐剂是一种能非特异性的增强机体对抗原的免疫应答能力，而本身并无免疫原性，能够发挥辅助作用的一类物质。目前研究较多的用于浸泡免疫的佐剂主要有皂土、莨菪碱、甘草素、葡聚糖、鸡蛋清和氯化钠等，由于每种佐剂的性质不同，在实际应用中要根据疫苗种类和免疫环境等进行恰当选择才能获得较好的免疫效果[38-40]。在DNA疫苗浸泡鱼体过程中，事先利用脂质体包埋疫苗或是运用超声波处理都能增强其免疫效果[41-42]。在实际应用中，通常在疫苗溶液中加入食盐或渗透剂等改变浸泡环境的渗透压来增加受免鱼体对疫苗的吸收量，增强免疫保护率[43-44]。

近年来，我国也开展了渔用疫苗浸泡免疫研究。罗霞等[29]研究发现，鳜鱼(Sinipercachuatsi)浸泡免疫嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)全菌疫苗7 d后，皮肤黏液中抗体滴度达到峰值。王庆等[45]研究得出，斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)被哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)灭活疫苗浸泡免疫后，鳃和皮肤等组织中MHC-Ⅱ类分子表达量及黏液抗体滴度均有不同程度的上调。刘雨果等[46]研究发现，鳜鱼经嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫后，皮肤黏液和血清抗体水平都有不同程度的提高。张燕飞等[47]发现，斑马鱼(Daniorerio)经溶藻弧菌(V.alginolyticus)减毒活疫苗浸泡免疫后，免疫保护率达到66.7%。经浸泡免疫后褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)的黏液细胞数量显著增加[48]。

综上所述，虽然我国研究证实了疫苗浸泡免疫可以一定程度增强水产动物的免疫保护力，但影响疫苗浸泡免疫效果的因素较多，若不从各个方面优化疫苗浸泡免疫程序，将严重阻碍我国水产疫苗浸泡免疫的推广应用。

2.3 口服免疫

口服疫苗主要是通过刺激鱼体肠道黏膜系统来产生免疫应答。虽然鱼类缺乏哺乳动物那样的相关肠道淋巴组织，但却具有大量的淋巴细胞。当抗原进入鱼体肠道后，小分子或可溶性物质可经细胞间隙进入血液，而大分子颗粒则经巨噬细胞等呈递给相关淋巴组织，引起机体相关的免疫应答反应。研究表明，口服疫苗可以让鱼体获得较好的免疫保护力[49]。但疫苗进入肠道后会被肠道相关消化酶等破坏，使免疫原性减弱，只有研究出一种有效的载体投递系统，才能降低鱼体胃肠道消化酶等对疫苗的影响[50]。

3种免疫方式效果的比较见表1。

表1 水产疫苗免疫方法的比较

3 面临问题

鱼类黏膜免疫系统自身存在一些缺陷及对浸泡免疫应答机制尚不清楚，目前尚无一套科学的适合水产疫苗浸泡免疫的接种方法，现行的方法还存在许多薄弱环节，如疫苗被鱼体摄入时抗原的性质是可溶性抗原还是颗粒性抗原；浸泡用疫苗制备工艺的研究、免疫环境条件的优化及免疫佐剂的选用等。同时，浸泡接种疫苗主要是通过皮肤和鳃等部位进行抗原的递送，效果往往较差，导致免疫保护效果不理想[51]。

在养殖生产中，大部分养殖户对疫苗浸泡免疫的流程了解较少，如浸泡工具的选用、浸泡时的水温、溶解氧、食盐用量的多少和渗透剂的选用等，若不能很好的掌握疫苗浸泡中的各个环节，就会导致鱼种浸泡后死亡率较高，免疫效果较差。因此，根据鱼种的大小和外界环境的变化等来确定合理的疫苗浸泡含量和浸泡时间等都是渔用疫苗浸泡免疫研究和推广中亟待解决的问题。

4 发展趋势

近些年来，随着分子生物学技术的飞速发展，相关鱼类皮肤黏膜免疫学研究越来越受重视，鱼类免疫基因的相关研究也取得了一定的进展，为深入研究鱼类皮肤黏膜免疫系统提供了参考依据[45]。同时，开发研制新型无毒且效率高的免疫佐剂以增强疫苗浸泡免疫效力，将是疫苗浸泡免疫得到很好应用的另一发展方向[52-53]。

水产疫苗浸泡免疫操作简单，对鱼体的刺激性也较小，且节省时间，可降低鱼类生产成本，所以选用浸泡免疫是一种较实用的免疫方案。尽管目前疫苗的注射接种在鱼类免疫中仍占主要位置，但实际操作劳动强度较大、容易造成鱼体损伤甚至死亡等，因此，水产疫苗浸泡免疫方式的研究和推广应用是未来鱼类免疫发展的方向。

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CurrentResearchStatusofVaccineImmersioninAquacultureinChina

YANG Xing， ZHANG Meiyan， ZHANG Xiaoping， SHANG Baodi， LI Zhengyou