猪源沙门菌分离鉴定与耐药性分析

蒋增海，徐耀辉*，邓同炜，赵攀登

(1.河南牧业经济学院 动物医学院，河南郑州 450046；2.河南省猪病防控工程技术研究中心，河南郑州 450046)

猪源沙门菌分离鉴定与耐药性分析

蒋增海1,2，徐耀辉1,2*，邓同炜1,2，赵攀登1,2

(1.河南牧业经济学院 动物医学院，河南郑州 450046；2.河南省猪病防控工程技术研究中心，河南郑州 450046)

2015年9月和2016年10月，河南省两猪场暴发保育仔猪的急性死亡，为了弄清原因，采集心血、肺脏和肝脏病料，通过常规分离、PCR鉴定、生化试验，分离到2株沙门菌，分别命名为HenanSep1、HenanSq2N。小鼠致病性试验结果显示，每只小鼠接种0.2 mL菌液，其浓度为5×108CFU/mL，均导致小鼠发病，但是无死亡。选取21种药物，采用K-B法对2个分离株进行药物敏感性测定。药敏试验结果表明，2株沙门菌对头孢噻呋、氨苄西林、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶、磺胺异恶唑、氯霉素、恩诺沙星耐药，对美罗培南、亚胺培南、氨曲南、多黏菌素B、土霉素敏感，对其他药物敏感性不同。研究结果为猪沙门菌病临床诊断与防治提供了重要依据。

猪；沙门菌；分离鉴定；药敏试验

猪源沙门菌的血清型相当复杂，猪沙门菌病主要由猪霍乱沙门菌(S.cholerasuis)、猪霍乱沙门菌Kunzendorf变型、猪伤寒沙门菌(S.typhisuis)、猪伤寒沙门菌Voldagsen变型、 鼠伤寒沙门菌(S.typhimurirum)、德尔陴沙门菌(S.derby)和肠炎沙门菌(S.enteritidis)等血清型引起[1]。 猪沙门菌病又称为仔猪副伤寒，临床上分为急性(败血型)、亚急性和慢性。本病常引起较高的病死率,其中败血型病死率达90%,慢性型病死率达25%～50%[2]。近年来，猪场仔猪副伤寒发病率呈上升趋势，叶润全等[3]报道从佛山周边地区送检兽医院门诊168份可疑病例中，经病原分离鉴定，分离到沙门菌51例，分离率达30.4%；据报道[4]，上海宝山地区养猪场卫生管理规范、饲养环境较好的猪场，猪霍乱沙门菌血清阳性率就低(10%)，而比较脏乱差且饲养密度大的猪场阳性率就高(可达75%)。由于猪沙门菌血清型众多，加之猪场不重视仔猪副伤寒的免疫，兽医临床滥用抗生素，因此仔猪副伤寒报道病例[5-9]较多在所难免，应引起重视。为弄清河南2个猪场保育仔猪急性死亡病因，总结临床经验，区别猪瘟、猪蓝耳病或猪链球菌病，开展了本次研究，为猪沙门菌病的诊断与防控提供重要参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集河南2个猪场保育仔猪急性死亡典型病例的病料；临床上，均表现为呼吸困难，咳嗽，精神不振，皮肤紫红色斑点，体温升高，后期拉稀，使用过氟苯尼考、替米考星等药物，疗效不佳，病死率50%～60%；病变为肺脏出血点，有的肝脏有一层纤维素性薄膜覆盖，并且有白色坏死点，腹股沟浅淋巴结肿大出血，肠系膜淋巴结索状肿大，胆汁充盈。

1.1.2 培养基 普通营养肉汤、营养琼脂及SS琼脂均为北京奥博星有限责任公司产品；50 mL/L绵羊鲜血琼脂平板为郑州博赛生物有限公司产品；TSA(胰蛋白大豆琼脂)、TSB(胰蛋白大豆肉汤)为美国BD(Becton,dickinson and company)公司产品；MH琼脂为英国Oxoid公司产品；TSA平板、TSB肉汤配制时，分别添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(缩写NAD，终浓度为10 mg/L)和犊牛血清(终浓度50 mL/L)。

1.1.3 药敏片 卡那霉素(K)、庆大霉素(CN)、阿米卡星(AK)，氨苄西林(AMP)，阿莫西林-克拉维酸(AMC)，头孢他啶(CAZ)、头孢唑林(KZ)，头孢曲松(CRO)，美罗培南(MEM)、亚胺培南(IPM)，氨曲南(ATM)，四环素(TE)、土霉素(OT)，多黏菌素B(PB)，氯霉素(C)，恩诺沙星(ENR)、环丙沙星(CIP)，磺胺甲恶唑(SXT)/甲氧苄啶、磺胺异恶唑(SF)、呋喃妥因(F)，均为英国Oxoid公司产品。

1.1.4 其他主要试剂 犊牛血清为杭州四季青生物有限公司产品；NAD为Roche公司产品，使用前均需过滤除菌；2×TaqPCR Master Mix为南京诺唯赞生物科技有限公司产品；DNA Marker DL 2 000为宝生物工程(大连)有限公司产品;各种生化试管均为青岛海博生物技术有限公司产品;大肠埃希菌ATCC25922质控菌株由扬州大学人兽共患病学江苏省重点实验室惠赠；麦氏比浊管为广东环凯微生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病菌分离、纯化 无菌采集典型病例的心血、肺脏、肝脏，分别接种于TSA平板(加有犊牛血清、NAD)、5%绵羊血琼脂平板、普通营养琼脂，37℃恒温箱，培养24 h～48 h，进一步用相同培养基纯化传代2～3次；然后将纯化的分离菌接种于SS琼脂平板，挑取单个菌落保存在20%的无菌甘油中，然后放在-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 染色镜检 将纯化的分离菌，革兰染色，显微镜下观察细菌形状和大小。

1.2.3 PCR鉴定 按照参考文献[11]设计一对引物，上游引物Sal1:5′-CAGGATACCTATAGTGCTGC-3′，下游引物Sal2：5′-CGCACCGTCAAAGGAACCGT-3。将纯化后的分离菌，接种TSB肉汤增菌后，用煮沸法提取细菌的DNA，作为PCR反应模板。PCR体系为25 μL，扩增程序为94℃ 4 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，35个循环；72℃ 10 min；4℃保存。扩增产物经10 g/L凝胶电泳检测，若与预期条带580 bp左右一致，即为阳性。

1.2.4 生化试验 按照生产厂家说明书操作。

1.2.5 小鼠致病性试验 将分离菌在普通营养琼脂复活培养12 h后，挑取单菌落，无菌接种于营养肉汤，37℃过夜培养，使用营养肉汤将其稀释为5×108CFU/mL菌液,每只小鼠腹腔接种0.2 mL，共接种4只；同时选择4只小鼠作为对照组，每只小鼠腹腔接种无菌营养肉汤0.2 mL。接种后，观察1周，记录接种后小鼠临床表现。

1.2.6 药敏试验 参照美国临床实验室标准化协会 (Clinical and laboratory standards institute,CLSI)手册进行药敏试验[12]，以E.coli(ATCC25922)为质控菌株，测定分离菌株的药物敏感性。首先将保存于-80℃分离菌在普通培养基上划线复活，培养18 h～24 h，挑取培养好的单个菌落4～6个，接种于5 mL肉汤中，放置摇床，37℃恒温，振荡培养2 h～6 h；然后取出，对比0.5和1.0麦氏比浊管，使菌悬液的浓度在二者之间且更接近于0.5麦氏比浊管的浓度，若浓度偏高可用无菌肉汤进行稀释；将稀释好的培养菌悬液在15 min内，用无菌棉签均匀涂于MH培养基上，重复两遍；然后将药敏片贴于其表面；将贴有药敏片的平板15 min内，放于37℃的恒温箱中培养16 h～18 h，取出后用直尺测量其直径。

2 结果

2.1 分离、培养特征

无菌采集心血、肺脏或者肝脏，分别接种于TSA平板(加有犊牛血清、NAD)、50 mL/L绵羊鲜血琼脂平板、普通营养琼脂平板，37℃培养24 h～48 h后，在同一种培养基上均能生长为相似菌落，纯化后，37℃培养24 h，在50 g/L绵羊血琼脂平板生长为无色透明、圆形、边缘整齐、湿润的大小约为0.5 mm～2 mm菌落，菌台生长为奶油状；分别纯化后，接种于SS琼脂平板，HenanSep1生长为无色透明、细小、圆形、光滑、中央无黑色点菌落，HenanSq2N生长为无色透明、细小、圆形、光滑、中央为黑色小点菌落。

2.2 染色、镜检

革兰氏染色，显微镜下观察到2株分离菌，均为革兰阴性、杆状、中等大小(图1和图2)。

2.3 PCR鉴定

将分离的2株疑似沙门菌复活，TSB增菌培养后，进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳，结果表明PCR扩增大小为于500 bp～750 bp(图3)，与预期PCR扩增产物片段580 bp大小一致，表明2株分离菌均为沙门菌。

2.4 生化试验

生化试验结果符合沙门菌生化特征，因此将2株分离菌鉴定为沙门菌(表1)。

表1 生化试验结果

注:“ +” 产酸 ;“ -” 阴性;“⊕” 产酸产气。

Note：“ +”Acid production ;“ -” Negative;“⊕”Acid and gas production.

2.5 小鼠致病性试验

接种HenanSep1菌10 h后开始出现临床症状，接种HenanSq2N菌16 h开始出现临床症状，均表现为精神不振、蹲伏、不愿活动、毛蓬松、怕冷、不愿采食等，持续观察1周无死亡，但是逐渐消瘦；而对照组，4只小鼠均活泼乱跳，无临床表现。结果表明2株沙门菌对小鼠均具有致病性。

2.6 药敏试验

将分离保存的2株沙门菌分别做药敏试验(表2)。2株沙门菌对头孢噻呋、氨苄西林、氯霉素、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶、磺胺异恶唑抑菌圈为零，属于完全耐药，同时对恩诺沙星也耐药；对美罗培南、亚胺培南、氨曲南、头孢曲松、多粘菌素B、土霉素等敏感，对其他药物敏感性不同。

3 讨论

自1885年Salmon等分离得到猪霍乱沙门菌以来,目前已检出沙门菌血清型2 500余种,我国已有292个血清型报道[13]。沙门菌在自然界中十分普遍，是一种条件致病菌，对家养畜禽健康、人类公共安全、食品安全都具有严重的影响，是一种重要的人兽共患病病原。猪可感染多个血清型，除猪霍乱沙门菌和鼠伤寒沙门菌外，很少有其他血清型能引起临床发病，但这些对猪非致病性的血清型可造成猪肉产品的感染，在公共卫生上具有重要意义[14]。本研究中，2例仔猪发病，分别采集典型病例的心血、肺脏、肝脏，接种各种培养基，37℃培养24 h～48 h，在相同培养基上均能生长为同一种类型菌落，推测在典型病例的心血、肺脏以及肝脏中，均存在这种病原菌，通过常规鉴定、生化鉴定、PCR鉴定，确定为沙门菌，小鼠致病性试验具有致病性，结合流行病学、临床症状和病理变化，将两次病例确诊为仔猪副伤寒。

表2 药敏试验结果

注：S.敏感；I.中介 ；R.耐药。

Note:S.Sensitive；I.Intermediary ； R.Resistance.

仔猪副伤寒临床上，很容易与猪蓝耳病、猪瘟、猪链球菌病、急性胸膜肺炎、副猪嗜血杆菌病等病混淆，导致误诊。孙华伟等[9]报道一起肥育猪沙门菌病被误诊为猪蓝耳病的病例，反映出基层散养户普遍存在一个误区，即只要猪耳朵出现发绀就怀疑是猪蓝耳病，猪沙门菌病作为老病和二类动物传染病不被重视。本研究为了确诊病例是否存在副猪嗜血杆菌或者而传染性胸膜肺炎放线杆菌感染，选择了这两种菌能生长的TSA平板(加有犊牛血清、NAD)培养，但是均未培养出相应的病菌。

药敏试验表明，2株沙门菌对兽医临床上常用药物头孢噻呋、氨苄西林、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶、磺胺异恶唑、恩诺沙星均耐药，但对人用药物美罗培南、亚胺培南、氨曲南、头孢曲松敏感性好；然而兽医临床禁止使用药物氯霉素也完全耐药，推测与兽医临床长期使用氯霉素类药物氟苯尼考有关，据养殖户反应上述两次病例中，均使用过氟苯尼考、替米考星等药物治疗，但是无效，病死率依旧高达50%～60%；2株沙门菌对土霉素、多黏菌素敏感，提示临床上可尝试选用这两种药物治疗仔猪副伤寒。本研究结果表明对氨苄西林100%耐药，对碳青霉烯类美罗培南、亚胺培南敏感，与文献报道一致[10]，提示临床上治疗仔猪副伤寒选择氨苄西林要谨慎。

对猪沙门菌防控最关键的是良好的饲养管理,对猪舍严格消毒，改善饲养管理与环境卫生、减少猪应激，对饮水、饲料等均应执行严格的兽医卫生管理，提高猪体自身免疫力，才能有利于控制沙门菌病的暴发，特别是季节交替，天气骤变，长途运输等恶劣情况下仔猪的预防更为重要。对于季节更替和仔猪断奶前后，可选择合适仔猪副伤寒疫苗免疫。

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Isolation,IdentificationandDrugResistanceAnalysisofSalmonellaIsolatesfromPiglets

JIANG Zeng-hai1,2,XU Yao-hui1,2，DENG Tong-wei1,2,ZHAO Pan-deng1,2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou,Henan,450046,China；2.HenanEngineeringandTechnologyResearchCenterofVeterinaryBiotechnology,Zhengzhou,Henan,450046,China)

In order to clarify the etiology of two cases of swine diseases,we collected the heart blood,lung and liver from diseased or dead piglets in two pig farms located in Henan province,China in September 2105 and October 2106.TwoSalmonellaisolates were obtained by the conventional isolation,PCR identification and biochemical identification,being named asSalmonellaHenanSep1 andSalmonellaHenanSq2N respectivly.The result of pathogenicity test in mice indicated that all of mice were sick rather than dead after inoculation with 0.2 mL 5×108CFU/mL concentration of 2Salmonellaisolates.Antimicrobial susceptibility of 2Salmonellaisolates was determined using 21 drugs by Kirby-Bauer method.The results showed that both of 2Salmonellaisolates were resistant to ceftiofur,ampicillin,sulfamethoxazole/trimethoprim,sulfamethoxazole,chloramphenicol,and enrofloxacin,being sensitive to meropenem,imipenem,aztreonam,polymyxin B,and oxytetracycline.This study provided an important basis for the clinical diagnosis and prevention of swine salmonellosis.

pigs;Salmonella; isolation and identification; antimicrobial susceptibility test

2017-03-04

河南省科技攻关计划项目(162102110144)；江苏省人兽共患病学重点实验室开放课题(R1407)；河南牧业经济学院预防兽医学重点学科建设项目(MXK2016102)

蒋增海(1976-)，男，四川简阳人，讲师，博士，主要从事猪病原微生物学研究。*

S852.612

B

1007-5038(2017)11-0121-05