西藏天然草地藏橐吾生物碱成分检测

郭亚洲，冯 柯，王 帅，孙 暾，路 浩，吴晨晨，赵宝玉*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.拉萨市动物疫病预防控制中心，西藏拉萨 851000)

西藏天然草地藏橐吾生物碱成分检测

郭亚洲1，冯 柯2，王 帅1，孙 暾1，路 浩1，吴晨晨1，赵宝玉1*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.拉萨市动物疫病预防控制中心，西藏拉萨 851000)

为初步探讨藏橐吾地上部分所含生物碱的种类，采用生物碱系统提取法，用薄层色谱、柱层析和GC-MS技术对藏橐吾所含生物碱进行检测。结果显示，从1.5 kg藏橐吾地上部分提取到酸性氯仿萃取段1.44 g、碱性氯仿萃取段0.81 g、碱性正丁醇段43.64 g，出膏率分别为0.096%、0.054%和2.91%。薄层色谱检测发现，酸性氯仿萃取段检测出2种生物碱，成点性一般；碱性氯仿萃取段检测出5种生物碱，成点性好；碱性正丁醇萃取段含有生物碱，成点性差。碱性氯仿萃取段经GC-MS检测，通过计算机质谱数据库系统检索及人工解析，共鉴定出26种化合物，占碱性氯仿萃取段47.08%，其中生物碱有千里光碱、全缘千里光碱、阔叶千里光碱和芥酸酰胺4种，相对含量分别为0.62%、8.86%、1.98%和2.32%。已鉴定的生物碱为首次从藏橐吾地上萃取段检出。

藏橐吾；生物碱；千里光碱；全缘千里光碱；西藏天然草地

藏橐吾(Ligulariarumicifolia)隶属菊科(Compositae)橐吾属(Ligularia)多年生草本，主要产于我国西藏东南部至东北部天然草地，生于海拔3700 m～4500 m的林下、湖边、灌丛及山坡砾石地[1]。近些年来，受气候变化、干旱、人口增长、过度采挖、超负荷放牧等自然和人为因素影响，西藏天然草地严重退化，导致植物种群结构明显改变，可食牧草减少，而伴随大量毒害草滋生，牲畜毒害草中毒灾害屡见不鲜。王力等[2]报道我国天然草地常见橐吾属植物，如黄帚橐吾(Ligulariavirgaurea)、网脉橐吾(Ligulariadictyoneura)、大黄橐吾(Ligulariaduciformis)、蹄叶橐吾(Ligulariafischeri)和箭叶橐吾(Ligularia.sagitta)等，均全株带毒；自1979年日本学者Hikichi M.首次从齿叶橐吾(Ligulariadentata)中检测到山岗橐吾碱后，关于橐吾属植物中吡咯哩西定生物碱的研究便逐步展开[3]；研究发现，舟叶橐吾(Ligulariacymbnlifera)、Ligulariamortonii及一种未命名橐吾属植物均含有肝毒性吡咯里西啶生物碱，是造成分布在不丹境内喜马拉雅边境地区牦牛中毒的有毒植物[4]。濮社班等[5]采用薄层色谱法、液相色谱与多级质谱联用法(LC/MSn)对22种橐吾属植物中的生物碱检测，发现18种橐吾属植物中含有肝毒性吡咯里西啶生物碱。

目前，藏橐吾已成为我国西藏高寒草原退化草地常见毒害草中的优势种群，严重影响草地质量，危害畜牧业发展[6]。冯柯等[7]根据小鼠急性毒性试验证实，藏橐吾有毒，且主要损伤器官为胃肠道、肝脏、脾脏等器官。但是，由于国内外对藏橐吾化学成分研究尚属空白，对于藏橐吾毒性成分及其毒性机制还不清楚，且缺乏有效防治牲畜藏橐吾中毒的措施。本试验通过对藏橐吾地上部分生物碱成分检测，初步阐明藏橐吾所含生物碱成分的种类，为进一步确证藏橐吾毒性成分及其毒作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物样品 2015年8月，采集藏橐吾地上部分全草，地点为西藏堆龙德庆(30°02′07.46″N；90°36′26.06″E)，由西北农林科技大学常朝阳研究员鉴定。

1.1.2 仪器与试剂 HP6890/5975C气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司产品；薄层色谱专用硅胶GF254及柱色谱用硅胶(100-200目和200-300目)，青岛海洋化工有限公司产品；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产品；DB-2A数显电热板，常州翔天实验仪器厂产品；氯仿等有机试剂为分析纯，四川西陇化工有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 生物碱重点预试 采用裴月湖主编的《天然药物化学实验指导》中介绍的植物生物碱成分重点预试方法[8]。在藏橐吾生物碱预试制备液中加入Dragendoff试剂，若出现橘红色或黄色沉淀；加入Wagner试剂，出若现棕色或褐色沉淀；加入Hager试剂，若出现黄色沉淀；加入Bertrand试剂，若出现灰白沉淀，则为阳性结果。

1.2.2 藏橐吾生物碱提取 藏橐吾草粉1.5 kg，利用工业酒精回流提取4 h～6 h后，减压回收称量醇浸膏。醇浸膏经酸化、碱化处理后，顺次加入氯仿和正丁醇分段萃取，得到各萃取段生物碱提取物[9]。准确称取各萃取段浸膏质量，计算出膏率。

1.2.3 生物碱各萃取部位TLC检测 分别取酸性氯仿萃取段、碱性氯仿萃取段和碱性正丁醇萃取段，加一定量590 mL/L乙醇溶解，虑去不溶物，点样于GF254薄层硅胶板，上行法展开，待溶剂前沿距薄层板上端1 cm处取出，用Dragendorff's试剂对生物碱进行专项显色，并记录显色斑点颜色，计算比移值[10]。

1.2.4 藏橐吾生物碱成分GC-MS检测 将生物碱显色清楚、成点性好的碱性氯仿萃取部位经柱层析净化除杂质，氯仿甲醇梯度洗脱，分段收集，TLC检测，合并含生物碱部分用于GC-MS检测(表1)。

表1 藏橐吾生物碱成分GC-MS检测条件

2 结果

2.1 生物碱重点预试

大多数生物碱的酸水溶液与生物碱沉淀试剂反应，生成有色的弱酸不溶性复盐或络合物沉淀。藏橐吾地上部分生物碱重点预试验结果中，均出现明显的有色沉淀，表明藏橐吾地上部分全草中可能含有生物碱成分。

2.2 生物碱提取结果

1.5 kg藏橐吾地上部分粉末得醇浸膏248.7 g，提取率为16.58%。醇浸膏用适量2%盐酸酸化，加等量氯仿萃取3次，减压回收溶剂；用50 g/L NaOH溶液将酸水液调至pH9～11，分别用氯仿和正丁醇萃取处理。得到酸性氯仿萃取段1.44 g、碱性氯仿萃取段0.81 g、碱性正丁醇萃取段43.64 g，出膏率分别为0.096%、0.054%和2.91%。

2.3 氯仿萃取部位薄层色谱分析结果

选用11种展开剂系统对藏橐吾酸性氯仿和碱性氯仿萃取萃取段所含生物碱进行TLC分析(表2)。结果显示，酸性氯仿萃取段和碱性氯仿萃取段以氯仿∶甲醇+氨水(10∶1+1 d)展开效果最佳，不论是显色斑点的数量，还是成点性，都优于其他展开剂。改良碘化铋钾显色酸性氯仿萃取段显出2个黄色斑点，碱性氯仿萃取段显出5个橙黄色斑点(图1)。

左：生物碱酸性氯仿萃取段；右：生物碱碱性氯仿萃取段

Lift is acidity chloroform extracts; Right is alkaline chloroform extracts

图1氯仿萃取段最佳展开剂改良碘化必钾显色图

Fig.1 The colored graph of the optimal developer for chloroform extract by Dragendorff's

2.4 碱性正丁醇萃取段薄层色谱分析结果

藏橐吾碱性正丁醇萃取段经二氯甲烷∶甲醇、乙酸乙酯∶甲醇、乙酸乙酯∶正丁醇等多种溶剂系统展开，改良碘化铋钾显色后，均可观察到明显橙黄色条带，但拖尾严重，成点性差。

2.5 碱性氯仿萃取段GC-MS检测

根据薄层色谱分析，发现碱性氯仿萃取段是生物碱主要集中部位。将其通过硅胶柱层析净化除杂，氯仿：甲醇梯度洗脱，收集含生物碱组份合并后进行GC-MS检测(图2)。各色谱峰相应的质谱图，经计算机质谱数据库系统检索和人工解析，并用面积归一化法测定各化合物的相对含量(表2)。共鉴定出26个单体化合物，占碱性氯仿萃取段47.08%，其中检测出4种生物碱成分，分别是千里光碱、全缘千里光碱、阔叶千里光碱和芥酸酰胺，相对含量为0.62%、8.86%、1.96%和2.32%，生物碱含量占碱性氯仿萃取段的13.78%。

表2 藏橐吾氯仿萃取段生物碱薄层色谱分析结果

注： “d”代表1滴。

Note:“d” means a drop.

图2 碱性氯仿萃取段总离子图

3 讨论

生物碱是一类氮的碱性化合物，多数具有复杂的氮杂环结构，有光学活性和显著的生理效应[11]。生物碱的发现始于19世纪初，是人们研究最早而且最多的一类天然有机化合物。大多数生物碱具有显著生理活性，往往是植物中重要的有效成分或毒性成分，因此一直成为天然产物的重要研究方向。双稠吡咯啶生物碱(PAs)作为生物碱的一大类群，广泛存在于多种植物中，迄今为止，PAs已在菊科千里光属、狗舌草属、橐吾属及泽兰属，紫草科聚合草属和天芥菜属，豆科野百合属等13个科植物中检出，截至目前，从自然界植物中已经发现600多种PAs[12]。Cheeke P R等[13]报道，家畜采食含有PAs植物或其种子，会导致中毒，且表现肝脏毒性，给草地畜牧业造成严重损失。此外，有研究表明，PAs还有致癌、致突变和致畸胎毒性，若在动物性产品中残留可影响食品安全。近年，研究者分别从我国特有的苍山橐吾(Ligulariatsangcbanensis)、鹿蹄橐吾(Ligulariahodgsonii)、洱源橐吾(Ligularialankongensis)、舟叶橐吾(Ligulariacymbulifera)、刚毛橐吾(Ligulariaachyrotricha)中分离到O-acetylyamataimine、O-acetylyamataimine N-oxide、clivorine、ligularine、lankongensisine A、lankongensisine B、1-((β-D-glucopyranosyloxy)methyl)-5,6-dihydropyrrolizin-7-one和ligulachyroine A等8种双稠吡咯啶生物碱[14-18]，并对其抗肿瘤活性进行初步研究，但未对毒性进行说明。王跃虎等[19]在研究菊科狗舌草(Tephroseriskirilowii)毒性时，发现生物碱是其主要毒性物质，测得小鼠LD50为75 mg/kg，并采用GC-MS技术从生物碱中检测出千里光碱、千里光非灵、全缘千里光碱、当归酰天芥菜定4种生物碱。王军等[20]认为PAs类生物碱进入动物体内后，在肝脏代谢成活性代谢物吡咯后产生肝毒性，引起肝细胞出血性坏死、肝巨红细胞症及静脉闭塞症等。藏橐吾作为西藏高寒草原主要优势毒害草，严重影响草地畜牧业发展和生态安全质量，但目前有关藏橐吾的研究仅限于生物学特性、生态学分布等，而其化学成分，尤其是毒性成分及其毒性机制的研究尚属空白[6]。

表2 碱性氯仿萃取段GC-MS检测结果

本试验结合文献资料以及课题组对藏橐吾急性毒性研究的基础上，对藏橐吾所含生物碱成分进行确定。从1.5 kg藏橐吾地上部分全草得到酸性氯仿萃取段1.44 g、碱性氯仿萃取段0.81 g、碱性正丁醇萃取段43.64 g，出膏率分别为0.096%、0.054%和2.91%。薄层色谱检测发现，酸性氯仿萃取段、碱性氯仿萃取段和碱性正丁醇萃取段均含有生物碱，但根据呈现斑点的数量和成点性判断，碱性氯仿萃取段检测出5种生物碱，且成点性好；GC-MS检测从碱性氯仿萃取段鉴定出千里光碱、全缘千里光碱、阔叶千里光碱和芥酸酰胺4种生物碱，相对含量分别为0.62%、8.86%、1.96%和2.32%。结果表明，从藏橐吾全草中检测出的4种生物碱相对含量占碱性氯仿萃取段的13.78%，是首次从藏橐吾中发现Pas类生物碱，丰富了藏橐吾化学成分的研究内容。结合课题组对藏橐吾小鼠急性毒性试验结果[7]，初步判断高含量的肝毒性吡咯里西啶生物碱可能是藏橐吾引起家畜中毒的主要毒性成分之一。在此基础上，课题组还将对藏橐吾所含生物碱成分进行专项分离，利用1H-NMR、13C-NMR、IR、MS等光谱手段对所分离生物碱单体化合物进行鉴定。并且通过体内、体外试验研究生物碱的毒性作用机制，为藏橐吾毒理学研究提供理论依据，为制定科学有效的防控措施及解毒方案具有重要意义。

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1989:47.

[2] 王 力，高 杉，周 俗，等.青藏高原东南部天然草地主要有毒植物调查研究[J].西北植物学报,2006,26(7):1428-1435.

[3] Hikichi M,Asada Y,Furuya T.Ligularidine,a new pyrrolizidine alkaloid fromLigulariadentata[J].Tetrahedron Lett,1979,20(14):1233-1236.

[4] 韩建林.导致牦牛吡咯烷生物碱中毒的植物种类的调查[J].国外畜牧学:草原与牧草,1995 (1):32-35.

[5] 濮社班,徐德然,张 勉,等.橐吾属植物中肝毒吡咯里西啶生物碱的LC/MSn检测[J].药学学报,2004,39(10):831-835.

[6] 赵宝玉.中国重要有毒有害植物名录[M].北京：中国农业科学技术出版社，2015:50.

[7] 冯 柯，郭亚洲，薛瑞旭，等.藏橐吾小鼠急性毒性试验[J].中国兽医杂志,2016,52(11):113-114.

[8] 裴月湖.天然药物化学实验指导[M].2版.北京:人民卫生出版社,2007:137.

[9] 谭承建,刘丽娜,胡毕斯哈勒图,等.黄花棘豆2种生物碱成分的鉴定[J].动物医学进展,2015,36(8):71-73.

[10] 薛瑞旭,权海云,任祯慧,等.疯草内生真菌Undifilumoxytropis次级代谢产物分析[J].动物医学进展,2016,37(7):64-70.

[11] 南京大学化学系有机化学教研室.有机化学(下册)[M].北京：高等教育出版社,1988:329.

[12] Roeder E.Medicinal plants in Europe containing pyrrolizidine alkaloids[J].Pharmazie,1995,50(2):83-98.

[13] Cheeke P R.Toxicity and metabolism of pyrrolizidine alkaloids.[J].J Animal Sci,1988,66(9):2343-2350.

[14] Tan A,Wang Z,He H,et al.New pyrrolizidine alkaloids fromLigulariatsangchanensis[J].Heterocycles,2003,60(5):1195-1198.

[15] Lin G,Rose P,Chatson K B,et al.Characterization of two structural forms of otonecine-type pyrrolizidine alkaloids fromLigulariahodgsoniiby NMR spectroscopy[J].J Natural Products,2000,63(6):857-860.

[16] Tan A M,Li Y S,Yang H,et al.Two new pyrrolizidines fromLigularialankongensis[J].Chinese Chem Lett,2004,15(1):68-70

[17] Liu C M,Wang H X,Wei S L,et al.Pyrrolizidine alkaloids and bisabolane sesquiterpenes from the roots ofLigulariacymbulifera[J].Helvetica Chimica Acta,2008,91(2):308-316.

[18] Hua L,Chen J,Gao K.A new pyrrolizidine alkaloid and other constituents from the roots ofLigulariaachyrotricha(Diels) Ling[J].Phytochem Lett,2012,5(3):541-544.

[19] 王跃虎，王建华，司红丽.狗舌草生物碱LD50测定及毒性成分分析[J].饲料工业,2003,24(5):34-35.

[20] 王 军,王长虹,王峥涛.吡咯里西啶生物碱的细胞毒性及致毒机制研究进展[J].国际药学研究杂志,2007,34(4):246-249.

AnalysisofAlkaloidcomponentsLigulariarumicifoliainNaturalGrasslandofTibet

GUO Ya-zhou1,FENG Ke2,WANG Shuai1,SUN Tun1,LU Hao1,WU Chen-chen1,ZHAO Bao-yu1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China; 2LhasaCityAnimalDiseasePreventionControlCenter,Lhasa,Tibet,851000,China)

In order to determine alkaloids in the aerial parts ofLigulariarumicifolia,this study adopted systemic extraction for alkaloid.We isolated and measured alkaloids from the aerial parts ofL.rumicifoliaby TLC,column chromatography and GC-MS.The results were as follows:The weights in the parts of acidity chloroform,alkaline chloroform and alkaline n-butyl alcohol were 1.44 g,0.81 g and 43.64 g from the aerial parts ofLigulariarumicifolia(1.5 kg),the rates were 0.096%，0.054% and 2.91%% respectively.By TLC,there are 2 alkaloids in acidity chloroform and 5 alkaloids in alkaline chloroform.However,in alkaline n-butyl alcohol,we found alkaloids,but the variety is unclear.By GC-MS,26 components were identified,accounting for 47.06% of the total contents of the part of chloroform.4 alkaloids were identified,which are senecionine(0.62%),integerrimine(8.86%),platyphylline(1.98%) and erucamide(2.32%).Alkaloids were identified for the first time from the aerial parts ofLigulariarumicifolia.

Ligulariarumicifolia; alkaloid; senecionine; integerrimine; natural grassland of Tibet

2017-05-17

农业部“十二五”公益性行业(农业)科研专项(201203062)

郭亚洲(1990- )，男，硕士研究生，主要从事动物中毒病与毒理学研究。*

S859.87

A

1007-5038(2017)11-0071-05