高效液相色谱-三重四级杆质谱分析血样中托吡酯及代谢物

(1.湖北省黄冈市罗田县九资河镇卫生院,黄冈 438636；2.盐城市第三人民医院,盐城 224005；3.江苏医药职业学院,盐城 224005)

高效液相色谱-三重四级杆质谱分析血样中托吡酯及代谢物

张朝辉1季宏建2巩克民3*

(1.湖北省黄冈市罗田县九资河镇卫生院,黄冈 438636；2.盐城市第三人民医院,盐城 224005；3.江苏医药职业学院,盐城 224005)

采用高效液相色谱-三重四级杆质谱(HPLC-MS/MS)，对血样中托吡酯及主要代谢物2,3-二羟基托吡酯，4,5-二羟基托吡酯进行一级质谱和二级质谱分析检测，首次建立了快速、高效、检测限更低的多反应质谱检测(MRM)分析方法，该方法成功应用于服用托吡酯联合苯妥英钠等其他药物的癫痫患者，同时准确地进行托吡酯及代谢物的血药浓度监测。

液相色谱-三重四级杆质谱 多反应监测 血样 托吡酯及代谢物

1 前言

托吡酯(TPM)具有广谱的抗神经兴奋和抗惊厥作用，主要用于抗癫痫和偏头痛的治疗，该药物口服生物利用度高达80%，蛋白结合率仅有13%～17%，消除半衰期达20～30h，托吡酯往往与其他抗癫痫药物一起服用如：卡马西平、苯妥英钠等控制癫痫症状，这些药物可导致托吡酯血药浓度的降低，因此定量研究托吡酯及其代谢物显得尤为重要。

对于托吡酯及其代谢物常用的分析检测方法为高效液相色谱法(HPLC)，但是该方法需要衍生化，存在操作繁琐，定量下限高的缺点[1]；气相色谱/质谱(GC/MS)联用技术，存在结构容易分解，托吡酯不适合进行GC/MS分析，目前已有一些文献报导关于LC/MS分析检测托吡酯的方法但是样品处理多采用液液萃取的方法[2-4]，存在操作繁琐的缺陷；本实验建立了托吡酯及其代谢物的LC/MS/MS多反应监测(MRM)分析检测方法，采用该方法可准确检测出托吡酯及其代谢物，该方法具有简单、准确、快速的优点。

2 实验部分

2.1 试剂

甲醇(色谱级，美国Merck公司)；超纯水(杭州娃哈哈集团有限公司)；甲酸(色谱级，Agilent公司)；其余试剂均为分析纯。空白血样(购自血站)。

托吡酯对照品(中国食品药品检定研究院)， 2,3-二羟基托吡酯对照品，4,5-二羟基托吡酯对照品(Sigma公司)

2.2 仪器及条件

ThermoFinigan TSQ Quantum Discovery Max型液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(HPLC配备四元比例阀输液泵，在线真空脱气机，自动进样器及其温控系统，ESI质谱电离源质谱，Xcalibur高级质谱工作站；十万分之一电子分析天平(德国Sartorius)；TGL-16G台式高速离心机(上海医疗器械有限公司)。

液相条件：A=超纯水，B=甲醇(色谱纯)，流动相流速0.5mL/min，梯度为5% B(0～2 min)-20%B(2～2.5min)-25%B(2.5min～4min)-90%B(4min～6min)-5%B(6min～7min)。液相色谱柱Waters Symmetry C18(4.6 mm×150 mm，3.5μm)，柱温箱温度35℃；三重四极杆质谱采用负离子模式，离子源温度设为300℃，离子源电离电压为2500V，雾化气流速为480L/h，离子采集方式采用多反应监测模式(MRM)。

2.3 标准溶液的配制

用分析天平分别准确称取托吡酯、2,3-二羟基托吡酯，4,5-二羟基托吡酯，用超纯水配制成浓度为1.0 mg/mL的储备液，将储备液用甲醇∶超纯水(80∶20)稀释后使用。

2.4 实验

对托吡酯、2,3-二羟基托吡酯，4,5-二羟基托吡酯的水溶液进行ESI-全扫描分析，确定目标化合物的质谱碎片和保留时间。选择合适的碎片离子进行子离子扫描，优化仪器参数，确定最优的母子关系离子对，建立筛选性高的MRM分析方法。

在空白血样中加入3个目标化合物，乙腈去蛋白沉淀，取上清液吹干，流动相复融后，按照建立的SRM方法进行分析检测。

对健康人血样乙腈去蛋白沉淀，浓缩后按照MRM方法进行托吡酯及代谢物的筛查分析。

3 结果与讨论

3.1 LC-ESI--MS结果

对TPM、4,5-二羟TPM和2,3-二羟TPM标准样品的水溶液进行ESI-全扫描分析，这些化合物的质谱图如图1所示，各化合物均检测到较强的[M-H]-碎片离子；另外，4,5-二羟TPM和2,3-二羟TPM还检测到[M+Cl]-离子。采用该方法获得TPM、4,5-二羟TPM和2,3-二羟TPM的最低检测限分别为：0.1、0.01和0.001mg·L-1。采用全扫描分析3个目标化合物的检测限较高，适合进行常量分析检测，不适于痕量目标化合物的检测。

从图1可以看出，TPM、4,5-二羟TPM和2,3-二羟TPM的主要碎片离子分别为m/z: 95.9和77.9，其中m/z333.6 碎片离子信号较弱。因此，分别选择m/z:178.1、和224.1碎片离子进行二级质谱研究。

3.2 LC-ESI-MS/MS结果

依据一级质谱分析获得的结果，分别选择TPM、4,5-二羟TPM和2,3-二羟TPM的本底干扰较小的碎片离子m/z95.9和77.9进行子离子分析，优化碰撞能量，使母离子可见，子离子强度最强，结果见表1。

表1 TPM、4,5-二羟基TPM、2,3-二羟基TPM信息

图1 目标化合物的色谱和质谱图(A.TPM、B.4,5-二羟TPM和C.2,3-二羟TPM)

实验结果表明：对于TPM选择30V碰撞能量和离子对m/z:338.1→77.9；对于4,5-二羟TPM选择35V碰撞能量和离子对m/z:298.1→77.9；对于4,5-二羟TPM，选择35V碰撞能量和离子对m/z: 298.1→77.9；在MRM模式下进行分析检测TPM、4,5-二羟TPM和2,3-二羟TPM，其定量限分别为：4、0.4和0.04μg·L-1。

目标化合物的质谱裂解解释为：化合物TPM的[M-H]-特征离子以碳为电荷中心，发生S-O键断裂同时单氢重排，丢失C6O2H10中性碎片；以不饱和氧为电荷中心，发生C-O键断裂同时单氢重排，产生结构为[C3O2H6]的碎片离子m/z:77.9；以及[SO3NH2]的碎片离子m/z:95.9；4,5-二羟TPM和2,3-二羟TPM都通发生C-C键断裂同时单氢重排，丢失C5O3H10中性碎片；以不饱和氧为电荷中心，发生C-O键断裂同时单氢重排，产生结构为[C3O2H6]的碎片离子m/z:77.9；以及[SO3NH2]的碎片离子m/z:95.9；进一步说明这些碎片离子的碎裂过程是特征的，采用建立的离子对进行3个目标化合物的定性是可靠的。

3.3 血样中托吡酯以及代谢物浓度的测定

将上述方法用于3位癫痫患者的血药浓度测定，结果见表2。

表2 3位癫痫患者的血药浓度监测结果

4 结论

本实验建立的HPLC-MS/MS(SRM)方法测定血样中的托吡酯和主要代谢物是有效的，检测限低，满足医学样品分析需求。

[1] Berry D J, Patsalos P N. Comparison of topiramate concentrationsin plasma and serum by fluorescence polarisation immunoassay[J].Ther Drug Monit,2000,22:460-464.

[2]赵娜,刘雪松,闫冬，等. HPLC-MS-MS 法测定人血浆中托吡酯的浓度[J].中国新药杂志,2011，20( 12):1108-1111.

[3]刘彬,李艳梅,张君梅，等. 托吡酯胶囊的药代动力学及生物等效性研究[J].儿科药学杂志,2014,20 (5):38-41.

[4]Britzi M, Soback S, Isoherranen N, Levy R H, Perucca E, Doose D R, Maryanoff B E, Bialer M. Analysis of topiramate and its metabolites in plasma andurine of healthy subjects and patients with epilepsy by use of a novel liquidchromatography-mass spectrometry assay[J].Ther Drug Monit, 2003,25:314-322.

2017-08-21

张朝辉，男，1971年出生，主管药师，专科，湖北省黄冈市罗田县九资河镇卫生院。

巩克民,男，1979年出生， 硕士，副教授,从事药物动力学和药物质量控制研究，江苏医药职业学院， E-mail：gkm110016@163.com。

信息简讯

全球首台3.0T/850型核磁共振分子成像超导磁体问世

近日，由潍坊新力超导磁电科技有限公司自主研发的全球首台3.0T/850型核磁共振分子成像超导磁体样机通过了专家组检测。由中国科学院院士叶朝晖等组成的专家检测组认为，该磁体各项指标均满足于3.0T核磁共振系统高质量成像要求，

达到国际先进水平，在临床应用及医疗科研方面具有重大的现实意义。它的问世不仅打破了国外技术长期垄断，也标志着我国高端医疗影像装备研发已走在世界前列。(科技日报)

Analysisofselectedtopiramateanditsmainmetabolitesinhumnplasmabyhighperformanceliquidchromtogrphytri-quadrupolemassspectrometry.

ZhangChaohui1，JiHongjian2，GongKemin3

(1.JiuziheHealth-Center,LuotianCountyHuanggangCityHubeiProvince,Huanggang438636,China；2.YanchengThirdPeople’sHospital,Yancheng224005,China;3.JiangsuVocationalCollegeofMedicine,Yancheng224005,China)

In this study, a novel liquid chromatogrphy-tandem mass spectrometry method for simultneous determination of topiramate and its main metabolites in human plasma was presented. It is the first method allowing the determination of plasma topiramate and its main metabolites in one run. The method was succeeded in metabolic investigation of topiramate disposition in patients with epilepsy by measurements of the metabolites in plasma.

HPLC-MS/MS；MRM，human plasma；topiramate and its main metabolites

10.3969/j.issn.1001-232x.2017.05.007