离子色谱-质谱联用法检测咖啡豆中的典型单糖和小分子寡糖

(1.青岛理工大学，青岛 266033；2.山东出入境检验检疫局，青岛266002；3.青岛舜宇恒平仪器有限公司，青岛266109；4.中国海洋大学，青岛266100；5.青岛出入境检验检疫局，青岛266000；)

仪器应用

离子色谱-质谱联用法检测咖啡豆中的典型单糖和小分子寡糖

张涛1，2蔡峰2，3崔鹤2*马继平1朱倩林4胡东青5

(1.青岛理工大学，青岛 266033；2.山东出入境检验检疫局，青岛266002；3.青岛舜宇恒平仪器有限公司，青岛266109；4.中国海洋大学，青岛266100；5.青岛出入境检验检疫局，青岛266000；)

建立了离子色谱-质谱联用技术测定咖啡豆中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖的分析方法。将样品粉碎后加入去离子水超声提取，经CarbopacTMPA20(3*150mm)色谱柱分离，以EGC(自动淋洗液发生器)在线产生KOH为淋洗液，梯度淋洗，流速0.38mL/min，抑制器采用外加水模式，采用柱后补液法(Na+源)，串联质谱进行检测。结果表明，在一定的质量浓度范围内，上述单糖和小分子寡糖的色谱峰面积与质量浓度呈线性相关，线性相关系数(r)均大于0.999，样品的加标回收率均落在88.0～97.7%范围内，相对标准偏差均在2.36～3.70%之间(n=6)。该方法充分解决了含碳量不同的糖之间的假阳性问题，方法简便、快速、准确,可推广应用于咖啡豆中典型单糖和小分子寡糖的同时测定。

离子色谱-质谱(IC-MS) 咖啡豆 单糖 寡糖

中国人促使咖啡从神饮药饮转变为大众休闲饮料[1]，咖啡以其独特的风味口感以及醒脑提神、抗忧郁等独特的生理活性成为世界上最常饮用的饮料之一[2]。鉴于咖啡豆中糖的成分和含量的不同会对咖啡的香气和口感产生一定的影响[3]，因此，咖啡豆中糖的含量需要进行严格的检测。

咖啡豆中主要含有的糖为单糖和小分子寡糖两大类。单糖就是不能再水解的糖类，是构成各种二糖和多糖分子的基本单位，常见的单糖如葡萄糖、果糖、木糖等[4]。寡糖又称低聚糖，为两个或两个以上(一般指2～10个)单糖单位以糖苷键相连形成的糖分子，常见的寡糖有蔗糖、麦芽糖、乳糖等[5]。目前，单糖和小分子寡糖的测定方法主要有液相色谱-蒸发光检测或示差荧光检测法[6-8]、离子色谱-安培检测器法[9，10]等，但上述方法存在灵敏度差、部分糖分离度差等缺点[11]。美国官方分析化学师协会(Association of Analytical Communities，AOAC)颁布的《AOAC 995. 13-速溶咖啡中的糖》标准中，对咖啡制品中糖的分析就存在木糖与甘露糖之间相互干扰的问题。近年来，质谱技术的发展为单糖和小分子寡糖的准确分析提供了强有力的技术支撑。本研究方法采用离子色谱对咖啡豆样品进行初步分离，然后进质谱检测(检测原理流程图见图1)，充分解决了含碳量不同的糖之间的假阳性问题，方法准确性高，分离度好，可推广应用于咖啡豆中典型单糖和小分子寡糖的同时测定。

图1 检测原理流程图

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ICS5000+型离子色谱仪(Thermo)，配有EGC淋洗液自动发生器、电导检测器和Chromeleon6.80色谱工作站；4000 Q Trap三重四级杆质谱系统(AB SCIEX)，配有ESI(电喷雾离子源)和Analyst1.6.2工作站；Milli-Q A10型超纯水纯化系统(美国Millipore公司)；粉碎机(浙江大德机械)；涡旋混合器(德国IKA)；高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；Pump 11 Elite 注射泵(HARVARD)。

阿拉伯糖(arabinose)、半乳糖(galactose)、葡萄糖(glucose)、蔗糖(sucrose)、木糖(xylose)、甘露糖(mannose)、果糖(fructose)、核糖(ribose)8种糖标准品(纯度均大于98%，购自Aladdin分析标准品)；三水合乙酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，乙腈(色谱纯，Merck)。

1.2 标准溶液配置

准确称取糖标准品0.1g(精确到0.01g)，置于100mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度线，得到浓度为1000mg/L的标准储备液，然后去离子水逐级稀释配置0.05～5.00mg/L的标准工作溶液。溶液均由电阻率为18.2MΩ.cm超纯水配制。所有标准溶液均在4℃下保存，当天使用。

1.3 实际样品制备

取咖啡豆样品适量，在粉碎机上粉碎，取粉碎后的样品 0.1g(精确到0.01g)，加入49.90g 去离子水，30摄氏度条件下震荡摇匀 20 min，5000r/min 离心 5min，取上层清夜过0.22μm 的微孔滤器后再过SPE柱(Agilent SAMPLIQ C18)，过滤后的待测溶液再分别稀释2倍*和100倍*后，直接进样分析。

*说明：实验发现，咖啡豆样品中蔗糖和其它7种待测糖相比，含量特别高，为保证检测数据的准确性，选择将咖啡豆样品待测液再稀释100倍后单独检测蔗糖；其它7种糖样品待测液再稀释2倍后直接进样分析。

1.4 色谱和质谱条件

(1)色谱条件

色谱柱：DionexCarbopacTMPA20分析柱(3*150mm)，DionexCarbopacTMPA20保护柱(3*30mm)，柱温30℃，KOH淋洗液梯度洗脱程序见表1，流速0.38mL/min，进样量25μL， AERS 500 2mm抑制器(Thermo)，抑制器采用外加水方式，再生流速为0.4mL/min，抑制电流120mA。

NE向断裂组：这组断裂在区内最为发育，带内主要发育角砾岩或糜棱岩，该组断裂被后期断裂带切穿，构成网格状，带内具有硅化、碳酸盐化及弱钾化，平面上呈舒缓波状，产状倾向60°～90°，倾角30°～60°。

表1 淋洗液梯度洗脱程序

(2)质谱条件

电喷雾正离子模式(ESI+)，源温度550℃，离子源GS1：30psi，离子源GS2：50psi，离子化电压4500eV；采集模式：选择离子检测(selected ion monitor，SIM)；气帘气(CUR)10psi；扫描时间200ms；其他条件见表2。

表2质谱检测条件

物质定量离子([M+Na+])DP电压(V)阿拉伯糖173270半乳糖203245葡萄糖203260蔗糖3652110木糖173270甘露糖203260果糖203260核糖173245

2 结果与分析

2.1 色谱质谱条件的优化

色谱柱和淋洗液梯度程序选择:DionexCarbopacTMPA20分析柱(3*150mm，Thermo)在OH-流动相体系下可以快速有效地分离糖醇、单糖、双糖和低聚糖，无需衍生化,可满足该次实验要求，但PA20柱子在低浓度洗脱条件下，随着实验进行，出峰时间不断前飘，为保证上述8种待测糖较好的分离度，同时避免因出峰时间前飘对实验的干扰，经实验摸索，选择了前20分钟低淋洗液浓度洗脱，待测物全部出峰后，选用高浓度淋洗液对色谱柱进行再生的方法(详细洗脱程序见表1)，该方法有效避免了PA20色谱柱在低浓度洗脱条件下出峰时间前飘的问题,确保了实验数据的准确性。

抑制器可以有效降低盐类等物质对待测物的干扰，同时防止质谱检测器被污染。抑制器选择AERS 500 2mm型，抑制电流选择120mA，抑制效果较好。

质谱检测选择电喷雾(ESI)离子源，正离子模式，在100～400范围内全扫描，采用峰面积外标法定量。实验发现，待测糖的分子离子峰均为[M+Na+]型，因此选择在柱后添加Na+源，待测物和Na+经三通汇合后进入质谱检测器(详细检测流程图见图1)。注射泵(Pump 11 Elite)Na+源流速为0.01 mL/min。Na+源配制方法如下：准确称取三水合乙酸钠(CH3COOHNa.3H2O)一定量置于容量瓶中，用去离子水配置成0.25mmol/L的NaAc溶液，然后以体积比NaAc溶液∶乙腈=9∶1混合后配制而成。

配置1mg/L的阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖混合标准品溶液，采用上述优化方案进样分析，取得良好的分离效果，且重复性良好，如图2所示。

图2 8种糖标准物质混合离子色谱-质谱图(1mg/L)

2.2 线性关系、检出限和定量限

表3 8种糖的线性范围、线性方程、相关系数、检出限、定量限

在实际样品中分别添加0.05、0.50、2.00mg/L 低、中、高3个水平的单一标准溶液，进行加标回收率和精密度试验。经检测，6种糖的平均回收率均在88.0～97.7%范围内，相对标准偏差(n=6)均落在2.36～3.70%之间，如表4所示。

续表4

2.4 实际样品的测定

采用上述方法对实际咖啡豆样品进行检测，结果如表5所示。样品色谱图见图3。

表5 不同产地咖啡豆样品中糖的检出情况 mg/kg

ND: 未检出

样品1 蔗糖测定谱图

样品2 蔗糖测定谱图

样品1 半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖测定谱图

样品2 半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖测定谱图

样品1 阿拉伯糖、核糖测定谱图

样品2 阿拉伯糖、核糖测定谱图

图3实际样品图

3 结论

建立了IC-MS法测定咖啡豆中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖的分析方法，本方法和离子色谱-安培检测器等方法相比，具有灵敏度更高，分离度更好的优点，而且解决了测定咖啡豆中不同含碳量的糖的假阳性问题，为咖啡豆中典型单糖和小分子寡糖的研究提供了理

论依据，适用于咖啡豆中多种糖的同时检测。可推广应用于咖啡豆中典型单糖和小分子寡糖的同时测定。

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DeterminationofrepresentativemonosaccharideandsmallmoleculeoligosaccharidesincoffeebeansbyIC-MS.

ZhangTao1，2，CaiFeng2,3，CuiHe2*，MaJiping1，ZhuQianlin4，HuDongqing5

(1.QingdaoTechnologicalUniversity,Qingdao266033,China；2.ShandongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Qingdao266002,China；3.QingdaoSunnyHengPingInstrumentCo.Ltd,Qingdao266109,China；4.OceanUniversityofChina,Qingdao266100,China；5.QingdaoEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Qingdao266000,China)

A method was established for determination of arabinose，galactose，glucose，sucrose，xylose，mannose，fructose and ribose in coffee beans by using ion chromatography-electrospray tandem mass spectrometry in a positive ESI mode. Samples were separated on CarbopacTMPA20(3×150mm)analysis column by gradient elution with KOH eluent generated from an eluent generator cartridge(EGC). The flow rate was 0.38mL/min and the post-column rehydration way(Na+source) was adopted.Under the optimal conditions, the linear correlation coefficient was better than 0.999. The recoveries were in the range of 88.0%-97.7% while RSD values were between 2.36%-3.70%(n=6). This method is sample，rapid and suitable for simultaneous determination of sugars in coffee beans.

ion chromatography-mass spectrometry(IC-MS)；coffee beans；monosaccharide；oligosaccharides

国家重大科学仪器设备开发专项(2012YQ090229)；青岛市民生计划项目(13-1-3-138-jh)；山东省科技发展计划(2011GFS12005)

10.3969/j.issn.1001-232x.2017.05.004

2017-04-24

张涛，男，1991年出生，硕士，环境分析化学专业，E-mail：zt75217@163.com。.