渥堆发酵牛蒡茶工艺条件的研究

于沛沛，屠玥之，许艳顺，姜启兴，王斌，杨方，夏文水

（江南大学食品学院，江苏无锡214122）

渥堆发酵牛蒡茶工艺条件的研究

于沛沛，屠玥之，许艳顺，姜启兴，王斌，杨方，夏文水*

（江南大学食品学院，江苏无锡214122）

对发酵牛蒡茶渥堆发酵工艺条件进行探究，以可溶性糖和总黄酮为特色指标，研究发酵量、水分含量、温度、时间、接种量对发酵工艺的影响，通过单因素和正交优化试验确定了最优发酵工艺。结果表明：最佳发酵条件为发酵量为1 000 g，含水量为40%，温度60℃，接种量3.5%，渥堆发酵时间21 d，正交试验中4个因素对综合评分的影响依次为含水量＞温度＞接种量＞时间。

渥堆发酵；牛蒡茶；发酵工艺

牛蒡是一种富含多种营养成分与生物活性成分的药食两用的高档蔬菜，目前已有多种牛蒡相关产品被开发，尤以牛蒡茶品居多，但是现有牛蒡茶品一般由牛蒡茶片简易风干或者烘烤制成，存在质量隐患，并且由于烘烤温度较高，其营养物质容易流失，不利于牛蒡在日常饮食中发挥其营养功能作用，同时牛蒡茶口感发涩，淡而无味，无法完全消费者的口感需求。本论文利用接入黑曲霉定向人工发酵处理渥堆发酵，控制其发酵进程，缩短发酵周期，丰富了营养功效成分，并且使冲泡出来的溶液更为透明澄清，颜色更加诱人并具有牛蒡发酵茶独特的风味，在口感上满足消费者的需求。为牛蒡资源的深度开发提供了一种新思路与理论依据[1]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

新鲜牛蒡（食品级）：市售；烘烤牛蒡茶（食品级）：天益食品（徐州）有限公司；黑曲霉CICC2169菌株：中国工业微生物菌种保藏中心；芦丁标准品、水合茚三酮、邻苯二酚、聚乙烯吡咯烷酮（分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

UV-1000紫外可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；FW80高速全能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；LPH-50生化培养箱、PHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱：上海-恒科技仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉菌液的制备

以牛蒡粉为碳源，添加量为35 g/L，氮源选择蛋白胨20 g/L，添加NaCl 5 g/L，ZnSO40.5 g/L时用醋酸盐缓冲液调节pH值为6.0，接种量为18 g/L在35℃下以200 r/min的摇瓶转速培养4 d后制成黑曲霉种子液，用作后续发酵牛蒡茶的人工接种的试验菌株。

1.2.2 发酵牛蒡茶的工艺流程

1.2.3 单因素试验

控制牛蒡样品品质和环境湿度为不变因素，对发酵条件中的水分含量、黑曲霉接种量、发酵量、温度及时间分别进行单因素试验，单因素每个变量设置4到5个水平，分析发酵牛蒡茶的功能性成分指标（包括总黄酮和可溶性糖）含量，具体如下。

1.2.3.1 发酵量对牛蒡茶渥堆发酵的影响

分别控制 250、500、1 000、1 500、2 000，为不同装样量，整个发酵堆控制含水量在40%，初始温度为50℃，渥堆发酵时间选择在20 d，接种量为2%。

1.2.3.2 含水量对牛蒡茶渥堆发酵的影响

分别控制15%、25%、30%、40%、50%为不同接种量，控制整个发酵堆的装罐量在1 000 g，初始温度为50℃，渥堆发酵时间选择在20 d，接种量为2%。

1.2.3.3 温度对牛蒡茶渥堆发酵的影响

分别控制 30、40、50、60、70 ℃为不同温度，控制整个发酵堆的装罐量在1 000 g，整个发酵堆控制含水量在40%，渥堆发酵时间选择在20 d，接种量为2%。

1.2.3.4 接种量对牛蒡茶渥堆发酵的影响

分别控制 0%、1%、2%、3%、4%、5%为不同接种量，控制整个发酵堆的装罐量在1 000 g，初始温度为50℃，渥堆发酵时间选择在20 d。

1.2.3.5 发酵时间

控制 14、16、18、20、22、24 d 为不同发酵时间，控制整个发酵堆的装罐量在1 000 g，含水量为40%，初始温度为50℃，接种量为2%。

1.2.4 正交优化试验

按照单因素试验结果，以不同含水量（A）、温度（B）、时间（C）、接种量（D）条件做L9（34）试验，以牛蒡中含有的可溶性糖含量和总黄酮含量为指标进行综合评价，确定最佳渥堆发酵牛蒡茶正交水平因素表，见表1。

综合分=牛蒡中可溶性糖隶属度×0.5+总黄酮隶属度×0.5

表1 发酵牛蒡茶渥堆发酵正交水平因素表Table 1 The orthogonal horizontal factor table of fermentation burdock tea

可溶性糖含量的测定：蒽酮比色法，参照NY/T 1278-2007《蔬菜及其制品中可溶性糖的测定铜还原碘量法》。

总黄酮含量的测定：牛蒡中总黄酮含量的测定根据NY/T 2010-2011《柑橘类水果及制品中总黄酮含量的测定》的方法做进一步改进。绘制标准曲线后，精确吸取1.0 mL溶液放于10 mL的容量瓶中，同时根据标曲的绘制，对样品的吸光度进行测定并带入方程后，计算得出牛蒡中的黄酮类物质含量[2]。

2 结果与讨论

2.1 发酵牛蒡茶发酵工艺参数的确定

2.1.1 渥堆发酵工艺条件的单因素试验

2.1.1.1 不同发酵量对渥堆发酵牛蒡茶活性成分的影响

不同发酵量对牛蒡茶中可溶性糖和总黄酮含量的影响见图1。

图1 不同发酵量对牛蒡茶中可溶性糖和总黄酮含量的影响Fig.1 Effect of sample loading capacity on the soluble sugar and total flavonoids in burdock tea

当发酵量较高时，可溶性糖和总黄酮的含量前期随着装样量的上升而升高，由于发酵量的上升，微生物繁殖旺盛，在生化反应过程中可以将大分子化合物分解成可溶性糖，同时在纤维素酶等一系列酶的生化作用下加快了牛蒡中黄酮类物质的析出[3]，在1 000 g下各种成分的组分达到一个最适宜的状态，所以后续渥堆发酵过程中选择1 000 g发酵量进行发酵。

2.1.1.2 不同水分含量对渥堆发酵牛蒡茶活性成分的影响

不同水分含量对牛蒡茶中可溶性糖和总黄酮含量的影响见图2。

图2 不同水分含量对牛蒡茶中可溶性糖和总黄酮含量的影响Fig.2 Effect of on the moisture on the soluble sugar and total flavonoids in burdock tea

初始潮水量的增加可以加快微生物的繁殖和一系列生化反应的进行，后期由于水分含量的过度上升时会导致厌氧细菌的大量滋生，同时茶片也会变软，外形的感官质量也会随之下降，所以应选择适宜的水分含量进行渥堆发酵。含水量增加使黑曲霉产菊粉酶活性增加，可以分解菊粉产生一些小分子果糖导致可溶性糖含量增加，合适的水分含量不仅有利于黑曲霉的稳定生长，同时也有利于酵母菌的生长，酵母菌可以在厌氧环境下将大分子糖分解成可溶性糖，同时总黄酮含量也呈现出上升趋势。综上，相对过高和过低的水分含量对于渥堆发酵过程中微生物的生长繁殖都有消极影响，因此选择30%～40%作为水分含量的单因素考察指标[4]。

2.1.1.3 不同温度对渥堆发酵牛蒡茶活性成分的影响

不同温度对牛蒡茶中可溶性糖和总黄酮含量的影响见图3。

从图3中可以看出，随着温度逐渐升高，微生物在相对适宜的条件下繁殖迅速，酶活力也达到最大，所以在相对高温高湿的环境下，微生物的生长旺盛，对于将大分子碳水化合物分解成可溶性糖和黄酮类活性物质的增加是有利的，另一方面如果发酵牛蒡茶的中心温度不够高，会导致微生物活动不剧烈，会使得发酵程度不十分明显，另一方面，温度太高会导致渥堆发酵中水分蒸发含量严重下降，同样不利于发酵的进行，所以，单因素条件下选择50℃～60℃作为适合温度的考量[5-7]。

图3 不同温度对牛蒡茶中可溶性糖和总黄酮含量的影响Fig.3 Effect of temperature on the soluble sugar and total flavonoids in burdock tea

2.1.1.4 不同接种量对渥堆发酵牛蒡茶中活性成分的影响

不同接种量对牛蒡茶中可溶性糖和总黄酮含量的影响见图4。

图4 不同接种量对牛蒡茶中可溶性糖和总黄酮含量的影响Fig.4 Effect of inoculum on the soluble sugar and total flavonoids in burdock tea

从图4中可以看出，随着接种量的增多，微生物发生了一系列的生化反应以及酶促反应激烈，可溶性糖含量随着接种量的增加呈现出先上升后下降的趋势，可以认为是由于接种量的增多带来了生化反应的剧烈，酶活力也随之增加，可以将大分子糖分解成可溶性糖，后期进入一个平缓期，是由于微生物自身也需要一些消耗成糖类物质[8-9]。同时黄酮类物质在后期由于发生氧化、聚合、偶联等反应生成其他的有色类物质，构成了牛蒡茶汤色红亮的原因，黄酮类物质的氧化也是有利于后期发酵牛蒡茶滋味的形成。综合考量，微生物的接种量不宜过高，接种量太高会导致外观上的不美观，挂满白霜不有利于产品的扩大化生产，并且接种量过高时功能性成分并没有显著增加，而微生物含量过低时渥堆发酵程不明显，发酵效果不好，所以选择2.5%～3.5%作为单因素区间进行考量[10-11]。

2.1.1.5 不同发酵时间对渥堆发酵中牛蒡活性成分的影响

不同发酵时间对牛蒡茶中可溶性糖和总黄酮含量的影响见图5。

图5 不同发酵时间对牛蒡茶中可溶性糖和总黄酮含量的影响Fig.5 Effect of time on the soluble sugar and total flavonoids in burdock tea

在发酵的前期过程中，微生物产生的酶类物质将大分子糖水解成可溶性糖，可溶性糖含量呈现出明显上升的趋势，随着时间的继续增加，游离氨基酸的分解速率会大于前期蛋白质合成氨基酸的速率，所以游离氨基酸的变化趋势呈现出一个相对平缓的趋势[12-13]。随着时间的延长，微生物的生长繁殖需要消耗掉一部分营养物质且生长速率也在放缓，活性物质的含量变化均进入一个相对平缓的时期，后期如果产品发酵时间过久，产品容易变软影响质构和口感，所以应选择20 d～22 d作为单因素最优时间考虑。

2.1.2 正交优化试验结果

通过单因素试验，选择含水量、温度、接种量、时间4个单因素试验设计正交试验L9（34）正交表，结果见表2和表3。

由表2和表3能够看出，综合可溶性糖含量和总黄酮含量比较其功能性成分，其最适渥堆反应条件：装样量为1 000 g时在含水量为40%，温度60℃条件下，接种量为3.5%时渥堆发酵21 d，可以达到最佳发酵条件。4个影响因素中可以看出含水量的影响程度最大，同时温度和接种量也对渥堆发酵的有一定程度的影响，时间的影响是最为不显著的。

表2 正交试验结果Table 2 The result of orthogonal test and range analysis

表3 结果方差分析Table 3 The result of analysis of Variance

对上述结果进行进一步分析，在显著水平α=0.05下，可知F0.05（2，2）=19.00，显然在显著水平0.05上，可知含水量，温度对结果有显著影响，而在F0.01（2，2）=99，对于渥堆发酵而言含水量有非常显著的影响。

2.2 正交试验验证分析

验证正交中方案最优结果有效性，见表4。

表4 正交验证试验表Table 4 The table of orthogonal test

4种不同条件下的中总黄酮和可溶性糖含量见图6。

图6 4种不同条件下的中总黄酮和可溶性糖含量Fig.6 The contents of total flavonoids and soluble sugar in 4 different conditions

对正交得到最佳方案与正交表中的最优6号方案同时结合自然渥堆发酵和未发酵的牛蒡茶方案进行横向比较分析，正交得到的最佳方案比较正交表中6号试验结果高，最优方案中牛蒡中可溶性糖和总黄酮含量较自然渥堆发酵的含量均有一定程度的提高，因此最佳方案能够明显提高牛蒡根部中的生物活性成分含量，并能够在牛蒡根部的一些普通营养成分消耗比较低的前提条件下显著提高了牛蒡根部的食用价值。

3 结论

本文对发酵牛蒡茶渥堆发酵工艺条件进行了探究，以可溶性糖和总黄酮为特色指标，研究了发酵量，水分含量、温度、时间、接种量对发酵工艺的影响，通过单因素和正交优化试验确定了发酵工艺，结果表明：在装样量为1 000 g时在含水量为40%，温度60℃条件，接种量为3.5%，渥堆发酵21 d时，正交试验中4个因素对综合评分的影响依次为含水量＞温度＞接种量＞时间。对于渥堆发酵而言，在显著水平0.05上，F0.05（2，2）=19.00，可知含水量，温度，接种量对结果有显著影响，而在F0.01（2，2）=99，对于渥堆发酵而言含水量有非常显著的影响。

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Study on the Technological Conditions of Pile Fermented Burdock Tea

YU Pei-pei，TU Yue-zhi，XU Yan-shun，JIANG Qi-xing，WANG Bin，YANG Fang，XIA Wen-shui*
（College of Food Science&Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

The pile-fermentation conditions of burdock tea were explored in this article.The effect of the fermentation content，moisture content，temperature，time and inoculum on the fermentation technology was studied，based on the soluble sugar and total flavonoids as characteristic indexes.Furthermore，the optimal fermentation process was determined by single factor and orthogonal optimization test.The optimum fermentation conditions were as follows：the fermentation content was 1 000 g，water content was 40%，the temperature was 60℃，inoculum was 3.5%，and pile-fermentation time was 21 d.The influence of four factors on the comprehensive score in the orthogonal test was as follows：moisture content＞temperature＞inoculum ＞ time.

pile fermented；burdock tea；fermentation process

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.016

江苏省食品安全与质量控制协同创新中心资助项目

于沛沛（1983—），女（汉），实验师，硕士，研究方向：食品加工与配料。

*通信作者：夏文水（1958—），男，教授，博士生导师。

2017-07-27