双波长HPLC法同时测定益肾衍嗣丸中4种成分的含量

肖保国（驻马店市第二中医院药剂科，河南驻马店 463000）

双波长HPLC法同时测定益肾衍嗣丸中4种成分的含量

肖保国＊（驻马店市第二中医院药剂科，河南驻马店 463000）

目的：建立同时测定益肾衍嗣丸中阿魏酸、梓醇、大黄素和大黄素甲醚含量的方法。方法：采用双波长高效液相色谱法。色谱柱为Kromasil-C18，流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（78∶22，V/V），流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm（阿魏酸、大黄素和大黄素甲醚）、210 nm（梓醇），柱温为30℃，进样量为10 μL。结果：阿魏酸、梓醇、大黄素和大黄素甲醚检测质量浓度线性范围分别为0.090 8～2.270 0 μg/mL（r＝0.999 9）、0.199 0～4.975 0 μg/mL（r＝0.999 3）、0.354 0～8.850 0 μg/mL（r＝0.999 9）、0.336 0～8.400 0 μg/mL（r＝0.999 7）；定量限分别为14.66、8.75、10.26、13.68 ng，检测限分别为5.66、2.67、3.78、4.25 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；加样回收率分别为101.15%～102.73%（RSD＝0.58%，n＝6）、99.20%～101.69%（RSD＝1.20%，n＝6）、100.90%～101.36%（RSD＝0.16%，n＝6）、95.64%～98.96%（RSD＝1.49%，n＝6）。结论：该方法准确可靠，操作简单，适用于益肾衍嗣丸中4种成分含量的同时测定。

高效液相色谱法；双波长；益肾衍嗣丸；阿魏酸；梓醇；大黄素；大黄素甲醚；含量

益肾衍嗣丸为河南省驻马店市第二中医院的院内制剂，由当归、熟地黄、制何首乌、黄芪、枸杞子、菟丝子、沙苑子、五味子、女贞子、山茱萸等中药组成，具有补肾、助阳、生精的功效[1-5]。当归、地黄和何首乌为方中君药，但目前尚未有同时测定该制剂中上述3种药材中相关主要活性成分含量的报道。鉴于此，笔者采用双波长高效液相色谱法（HPLC），建立了同时测定该制剂中当归的主要活性成分阿魏酸[6-7]、地黄的主要活性成分梓醇[8-9]、何首乌的主要活性成分大黄素和大黄素甲醚[10-11]的含量，以期为完善该制剂的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包括G1311C四元梯度泵带真空脱气机、G1329B标准自动进样器、G4212B二极管阵列检测器、M8500AA色谱工作站（美国Agilent公司）；AG135型十万分之一电子分析天平（瑞士Me-ttler-Toledo公司）；Synergy 185型超纯水仪（美国Millipore公司）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

益肾衍嗣丸（河南省驻马店市第二中医院自制，批号：20161201、20161202、20161203，规格：1 g/丸）；阿魏酸对照品（批号：110773-201611，纯度：＞99.0%）、梓醇对照品（批号：110808-201601，纯度：＞99.0%）、大黄素对照品（批号：110756-201110，纯度：＞98.7%）、大黄素甲醚对照品（批号：110789-201611，纯度：＞99.0%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为纯化水。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（78∶22，V/V）；流速：1.0mL/min；检测波长：280 nm（阿魏酸、大黄素和大黄素甲醚）、210 nm（梓醇）；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取阿魏酸、梓醇、大黄素、大黄素甲醚对照品分别为 9.08、9.95、8.85、8.40 mg，各置于10、10、5、5 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得单一对照品贮备液。取上述阿魏酸、梓醇、大黄素、大黄素甲醚单一对照品贮备液各0.5、1、1、1 mL，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取样品粉末约1.0 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，加75%甲醇溶液50 mL，于50℃温浸 2 h，超声（功率：500 W，频率：40 kHz，下同）处理30 min，滤过，重复提取2次，合并提取液，减压回收溶剂至干，加甲醇溶解并转移至100 mL量瓶中，定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按样品的制备工艺和处方比例，制备不含当归、地黄和何首乌的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分峰与其他相邻峰均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以阿魏酸峰计为10 000，保留时间为35.1 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，作为系列混合对照品溶液。取上述系列混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归。回归方程与线性范围见表1。

2.5 定量限（LOQ）与检测限（LOD）考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得LOQ；当信噪比为3∶1时，得LOD。结果，阿魏酸、梓醇、大黄素和大黄素甲醚的LOQ分别为 14.66、8.75、10.26、13.68 ng，LOD 分别为 5.66、2.67、3.78、4.25 ng。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，阿魏酸、梓醇、大黄素和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为1.26%、1.17%、0.36%、1.43%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：20161201）适量，分别于室温下避光放置 0、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，阿魏酸、梓醇、大黄素和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为 1.20%、0.39%、1.27%、1.17%（n＝10），表明供试品溶液在室温下放置72 h内稳定性良好。

图1 高效液相色谱图A1.mixed control（210 nm）；A2.mixed control（280 nm）；B1.test sample（210 nm）；B2.test sample（210 nm）；C1.negative control（210 nm）；C2.negative control（280 nm）；1.catalpol；2.emodin；3.ferulic acid；4.emodin methyletherFig 1 HPLC chromatograms

表1 回归方程与线性范围Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.8 重复性试验

取样品粉末（批号：20161201）6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，阿魏酸、梓醇、大黄素和大黄素甲醚含量的平均值分别为0.111 8、0.266 9、0.428 2、0.424 3 mg/g，RSD 分别为1.89%、0.82%、1.81%、1.53%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取样品粉末（批号：20161201）适量，共6份，每份约1.0 g，精密称定，分别置于100 mL量瓶中，各加入一定质量的待测成分对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 样品含量测定

取3批样品粉末各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（n＝3，mg/g）Tab 3 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

笔者采用二极管阵列检测器进行全波长扫描发现，梓醇在210 nm波长处有最大吸收，阿魏酸、大黄素和大黄素甲醚在280 nm波长处有最大吸收，故本试验采用上述两种波长进行试验。

3.2 流动相的考察

笔者考察了不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.2%醋酸铵、甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相时的色谱情况。综合考虑保留时间、峰形、分离度等，最终确定本试验的流动相为定甲醇-0.1%磷酸溶液（78∶22，V/V）。

3.3 提取溶剂及提取时间的考察

本试验比较了水、50%甲醇溶液、75%甲醇溶液、甲醇为提取溶剂时的提取效果，结果75%甲醇溶液提取效果最佳。因此，选择75%甲醇溶液为提取溶剂。同时，还考察了超声提取时间（15、30、60 min），结果表明，30 min与60 min时样品提取效果基本相似，为节约试验时间，最终选择超声时间为30 min。

综上所述，本方法准确可靠，操作简单，适用于益肾衍嗣丸中4种成分含量的同时测定。

[1]张文，沈创鹏.加味当归补血汤联合左卡尼汀治疗少弱精子症临床观察[J].新中医，2011，43（8）：89-90.

[2]梁培育，李浩勇，肖劲逐，等.添加黄芪注射液对人精子线粒体功能的影响[J].中国男科学杂志，2004，18（3）：11-13.

[3]王战红，谭玉彬，李淑芳，等.高效液相色谱法测定双黄连口服液有效部位中连翘苷含量[J].中国中医药信息杂志，2012，19（3）：52-53.

[4]许国彬，许仙.中草药治疗少弱精子症的研究进展[J].宁夏医学杂志，2011，33（3）：276-278.

[5]赵文静，王历，王芝兰，等.淫羊藿的药理作用及临床应用研究进展[J].中医药信息，2016，33（2）：105-108.

[6]潘莹.HPLC法同时测定通脉颗粒中丹参素、阿魏酸和葛根素的含量[J].中国药房，2011，22（4）：376-378.

[7]申安.高效液相色谱法测定不同产地当归中阿魏酸的含量[J].中医学报，2015，30（3）：421-422.

[8]陈天朝，翟来超.HPLC同时测定地黄中梓醇与毛蕊花糖苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（5）：105-107.

[9]许继承，高明波，王婷，等.HPLC测定地黄叶与生地、熟地中梓醇含量[J].广州化工，2015，43（12）：104-105、155.

[10]童妍，金钊.大黄素甲醚的药理作用研究进展[J].中华中医药学刊，2015，33（4）：938-940.

[11]颜永刚，尹立敏，王红艳，等.HPLC法同时测定大黄炮制品中10种化学成分的含量[J].中国药房，2016，27（27）：3839-3842.

Simultaneous Determination of 4 Kinds of Components in Yishen Yansi Pills by Double Wavelength HPLC

XIAO Baoguo（Dept.of Pharmacy，Zhumadian Second Hospital of TCM，Henan Zhumadian 463000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of ferulic acid，catalpol，emodin and emodin methylether in Yishen yansi pills.METHODS：Double wavelength HPLC method was adopted.The separation was performed on Kromasil-C18column with mobile phase methanol-0.1%phosphate solution（78∶22，V/V）at flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were set at 210 nm for catalpol，280 nm for ferulic acid，emodin and emodin methylether.The column temperature was 30 ℃，and sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges were 0.090 8-2.270 0 μg/mL for ferulic acid（r＝0.999 9），0.199 0-4.975 0 μg/mL for catalpol（r＝0.999 3），0.354 0-8.850 0 μg/mL for emodin（r＝0.999 9），0.336 0～8.400 0 μg/mL for emodin methylether（r＝0.999 7），respectively.The limits of quantitation were 14.66，8.75，10.26，13.68 ng，and the limits of detection were 5.66，2.67，3.78，4.25 ng，respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%.The recoveries were 101.15%-102.73%（RSD＝0.58%，n＝6），99.20%-101.69%（RSD＝1.20%，n＝6），100.90%-101.36%（RSD＝0.16%，n＝6），95.64%-98.96%（RSD＝1.49%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is accurate，reliable，simple and suitable for simultaneous determination of 4 kinds of components in Yishen yansi pills.

HPLC；Double wavelength；Yishen yansi pills；Ferulic acid；Catalpol；Emodin；Emodin methylether；Content

R927.2

A

1001-0408（2017）33-4735-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.35

＊主管药师。研究方向：药剂学。电话：0523-86201292。E-mail：403509636@qq.com

（编辑：刘 柳）

2017-04-26

2017-06-23）