HPLC法同时测定妇乐颗粒中4种成分的含量

罗晓霞，曾偲偲，祁龙凯（.广东省中医院药学部，广州500；.广州中医药大学中药学院，广州50006）

HPLC法同时测定妇乐颗粒中4种成分的含量

罗晓霞1＊，曾偲偲1，祁龙凯2（1.广东省中医院药学部，广州510120；2.广州中医药大学中药学院，广州510006）

目的：建立同时测定妇乐颗粒中没食子酸、绿原酸、芍药苷、丹皮酚含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为月旭XB-C18，流动相为甲醇-0.05%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为270 nm（没食子酸、丹皮酚）、325 nm（绿原酸）、230 nm（芍药苷），柱温为30℃，进样量为10 μL。结果：没食子酸、绿原酸、芍药苷和丹皮酚检测进样量线性范围分别为0.076 2～1.524 μg（r＝0.999 7）、0.037 6～0.751 μg（r＝0.999 9）、0.030 3～0.606 μg（r＝0.999 7）、0.020 6～0.412 μg（r＝0.999 8）；定量限分别为0.353、0.276、0.421、0.540 μg/mL，检测限分别为0.121、0.104、0.148、0.186 μg/mL；精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤2.04%；加样回收率分别为95.24%～100.47%（RSD＝1.59%，n＝9）、99.49%～103.70%（RSD＝2.27%，n＝9）、96.27%～101.09%（RSD＝1.94%，n＝9）、95.05%～98.90%（RSD＝1.22%，n＝9）。结论：该方法操作简单、结果准确、重复性良好，可用于妇乐颗粒中没食子酸、绿原酸、芍药苷、丹皮酚含量的同时测定。

妇乐颗粒；高效液相色谱法；没食子酸；绿原酸；芍药苷；丹皮酚；含量

妇乐颗粒是由忍冬藤、大血藤、牡丹皮、赤芍、川楝子、熟大黄等中药制成的复方制剂，具有清热凉血、化瘀止痛的功效；常用于瘀热蕴结所致的带下病，症见带下量多、色黄，小腹疼痛，慢性盆腔炎见上述证候者，为妇科常用药[1]。目前妇乐颗粒收载于2015年版《中国药典》（一部）[1]及部颁标准《卫生部药品标准·中药成方制剂》（第18册）[2]；前者仅要求测定大黄中大黄素和大黄酚的含量，后者也只要求测定牡丹皮中丹皮酚的含量，两者均缺乏对忍冬藤主要活性成分绿原酸[3]，大血藤主要活性成分没食子酸、绿原酸等[4-5]，赤芍、牡丹皮主要活性成分没食子酸、芍药苷、丹皮酚等的测定[6-9]。因此，笔者采用高效液相色谱法（HPLC）建立了测定妇乐颗粒中没食子酸、绿原酸、芍药苷、丹皮酚含量的方法，以期为完善该制剂的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

E2695型HPLC仪，包括2998二级管阵列检测器（美国Waters公司）；BP211D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；KQ-200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q型超纯水机（德国Merck公司）。

1.2 药品与试剂

妇乐颗粒（湖北襄阳隆中药业集团有限公司，批号：151018、160404、160820、160918，规格：6 g/袋）；没食子酸对照品（批号：110831-201630）、绿原酸对照品（批号：110753-201716）、芍药苷对照品（批号：110736-201640）、丹皮酚对照品（批号：110708-201407）均购自中国食品药品检定研究院，纯度均≥98.0%；甲醇和磷酸均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：月旭XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，5%→11%A；8～18 min，11%→13%A；18～19 min，13%→15%A；19～27 min，15%→18%A；27～28 min，18%→53%A；28～38 min，53%→60%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm（没食子酸、丹皮酚）、325 nm（绿原酸）、230 nm（芍药苷）；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 取没食子酸、绿原酸、芍药苷和丹皮酚对照品各适量，精密称定，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成每1 mL含没食子酸152.4 μg、绿原酸75.1 μg、芍药苷60.6 μg、丹皮酚 41.2 μg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取样品1袋，置于研钵中，研成细粉，真空干燥过夜后，精密称取样品粉末1.0 g，至于50 mL具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，超声（功率：150 W，频率：40 kHz，下同）处理20 min，放冷后用甲醇补足减失的质量，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按样品的制备工艺和处方比例，制备分别缺大血藤、赤芍、牡丹皮，缺忍冬藤、大血藤，缺赤芍、牡丹皮的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液，即得。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以没食子酸峰计为5 500，保留时间为6.948 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 线性关系考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.5、1.0、2.5、5.0、10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归。回归方程与线性范围见表1。

表1 回归方程与线性范围Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限（LOQ）与检测限（LOD）考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得LOQ；当信噪比为3∶1时，得LOD。结果，没食子酸、绿原酸、芍药苷和丹皮酚的LOQ分别为 0.353、0.276、0.421、0.540 μg/mL，LOD 分别为0.121、0.104、0.148、0.186 μg/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，没食子酸、绿原酸、芍药苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为1.27%、0.85%、1.04%、0.98%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：151018）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、16、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，食子酸、绿原酸、芍药苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为1.39%、1.02%、1.50%、1.85%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取样品（批号：151018）适量，共6份，每份约1.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，没食子酸、绿原酸、芍药苷和丹皮酚的含量平均值分别为 3.41、1.03、0.64、0.36 mg/g，RSD 分别为1.68%、2.04%、1.81%、1.70%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取样品（批号：151018）适量，共9份，每份约0.5 g，精密称定，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，各加入低、中、高质量的待测成分对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 2 Result of recovery tests（n＝9）

2.10 样品含量测定

取4批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（n＝3，mg/g）Tab 3 Result of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3 讨论

3.1 流动相的选择

笔者曾考察了甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸溶液和甲醇-0.05%磷酸溶液为本试验的流动相体系对色谱分离的影响。结果，当采用甲醇-0.05%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱时，待测成分达到基线分离，峰形良好，且分析时间短，故选择上述溶液为流动相。

3.2 检测波长的选择

通过二极管阵列检测器在210～400 nm波长范围内进行扫描发现，没食子酸丹皮酚在270 nm波长处、绿原酸在325 nm波长处、芍药苷在230 nm波长处分别具有最大吸收峰，故采用波长切换技术最终确定本试验的检测波长为270 nm（0～10 min，没食子酸）、325 nm（10～20 min，绿原酸）、230 nm（20～30 min，芍药苷）、270 nm（30～43 min，丹皮酚）。

3.3 提取溶剂的选择

笔者曾考察了水、50%甲醇溶液、75%甲醇溶液、甲醇作为提取溶剂进行超声提取时待测成分的提取效果。结果发现，50%甲醇溶液、75%甲醇溶液、甲醇溶液3种提取溶剂的提取效果无明显差异，但50%甲醇和75%甲醇溶液较难过滤，故采用甲醇作为提取溶剂。

综上所述，本方法操作简单、结果准确、重复性良好，可用于妇乐颗粒中没食子酸、绿原酸、芍药苷、丹皮酚含量的同时测定。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：896-897.

[2]卫生部.卫生部颁药品标准：中药成方制剂：第18册[S].WS3-B-3403-98.

[3]于晓，李松涛，刘建升，等.RP-HPLC法同时测定忍冬藤中绿原酸、马钱苷、芍药苷含量的研究[J].山东农业科学，2015，47（9）：124-126、145.

[4]刘晓涵，祁龙凯.UPLC法同时测定大血藤中4种成分的含量[J].中药新药与临床药理，2016，27（5）：689-692.

[5]马瑞丽，于小凤，徐秀泉，等.大血藤的化学成分及药理作用研究进展[J].中国野生植物资源，2012，31（6）：1-5.

[6]陆小华，马骁，王建，等.赤芍的化学成分和药理作用研究进展[J].中草药，2015，46（4）：595-602.

[7]邓开英，朱必越，朱照静.改良RP-HPLC法同时测定牡丹皮药材中芍药苷和丹皮酚的含量[J].中国药房，2013，24（15）：1406-1408.

[8]范旭航，马天成，沈旭，等.UPLC法测定不同产地不同部位牡丹皮中6种活性成分[J].中成药，2012，34（2）：317-320.

[9]刘杰，陈琳，范彩荣，等.基于HPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS的白芍和赤芍主要成分定性定量研究[J].中国中药杂志，2015，40（9）：1762-1770.

Simultaneous Determination of 4 Components in Fule Granules by HPLC

LUO Xiaoxia1，ZENG Caicai1，QI Longkai2（1.Dept.of Pharmacy，Guangdong Provincial Hospital of TCM，Guangzhou 510120，China；2.College of TCM，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of gallic acid，chlorogenic acid，paeoniflorin and paeonol in Fule granules.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Ultimate XB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were 270 nm（gallic acid，paeonol），325 nm（chlorogenic acid）and 230 nm（paeoniflorin）.The column temperature was 30 ℃，and sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of gallic acid，chlorogenic acid，paeoniflorin and paeonol were 0.076 2-1.524 μg（r＝0.999 7），0.037 6-0.751 μg（r＝0.999 9），0.030 3-0.606 μg（r＝0.999 7），0.020 6-0.412 μg（r＝0.999 8），respectively.The limits of quantification were 0.353，0.276，0.421，0.540 μg/mL，and the limits of detection were 0.121，0.104，0.148，0.186 μg/mL.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all no more than 2.04%.The recoveries were 95.24%-100.47%（RSD＝1.59%，n＝9），99.49%-103.70%（RSD＝2.27%，n＝9），96.27%-101.09%（RSD＝1.94%，n＝9），95.05%-98.89%（RSD＝1.22%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reproducible，and can be used for the simultaneous determination of gallic acid，chlorogenic acid，paeoniflorin and paeonol in Fule granules.

Fule granules；HPLC；Gallic acid；Chlorogenic acid；Paeoniflorin；Paeonol；Content

R927.2

A

1001-0408（2017）33-4732-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.34

＊主管药师。研究方向：医院药学。E-mail：Yuerluo@qq.com

（编辑：刘 柳）

2017-06-07

2017-08-12）