HPLC法测定安神补脑液中防腐剂的含量Δ

陈灵君，王发英，王伟影#（1.浙江中医药大学附属第三医院，杭州310005；.丽水市食品药品与质量技术检验检测院，浙江丽水 33000）

HPLC法测定安神补脑液中防腐剂的含量Δ

陈灵君1＊，王发英2，王伟影2#（1.浙江中医药大学附属第三医院，杭州310005；2.丽水市食品药品与质量技术检验检测院，浙江丽水 323000）

目的：建立测定安神补脑液中防腐剂含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18，流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为236 nm，柱温为30℃，进样量为10 μL。结果：苯甲酸和羟苯乙酯检测质量浓度线性范围分别为12.85～128.54µg/mL（r＝0.999 9）、4.05～40.48µg/mL（r＝0.999 8）；定量限分别为0.514、1.012 μg/mL，检测限分别为0.171、0.353 μg/mL；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜1.0%；加样回收率分别为99.38%～100.21%（RSD＝0.31%，n＝6）、97.96%～100.72%（RSD＝0.91%，n＝6）。结论：该方法操作简单、结果准确，可用于安神补脑液中防腐剂的含量测定。

高效液相色谱法；安神补脑液；防腐剂；含量

安神补脑液是由鹿茸、制何首乌、淫羊藿提取物及维生素B1等加入单糖浆/蔗糖溶液/果糖溶液及防腐剂制成的复方中药制剂，具有生精补髓、益气养血、强脑安神的功效；可用于肾精不足、气血两亏所致的头晕、乏力、健忘、失眠等症的治疗[1]。该制剂收载于2015年版《中国药典》（一部），现行标准只对处方中部分药味进行了鉴别或含量的测定，但对其中的防腐剂尚未作出规定[1]。安神补脑液中所用的防腐剂为常用化学防腐剂——苯甲酸和羟苯乙酯。过量使用苯甲酸不仅破坏维生素B1、影响人体对钙的吸收、刺激胃肠道、损坏神经系统，而且还会对人体肝脏造成危害，具有致癌性、细胞毒性[2-3]；过量使用羟苯乙酯会产生变态反应以及类激素作用[4]。为保证患者的用药安全，笔者参考相关文献[5-7]，采用高效液相色谱法（HPLC）建立了测定该制剂中防腐剂含量的方法，以期为完善该制剂的质量标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪、包括G4212B二极管阵列检测器、G1329B自动进样器、Aglient色谱工作站（美国Agilent公司）；XS105DU型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-QA10型超纯水仪（美国Millipore公司）

1.2 药品与试剂

安神补脑液（吉林敖东延边药业股份有限公司，批号：1512026、1604211、1604213、1606214、1609020，规格：10 mL/支）；苯甲酸对照品（批号：100419-201202，纯度：100%）、羟苯乙酯对照品（批号：00847-201102，纯度：99.9%）均购自中国食品药品检定研究院；乙睛、甲醇和磷酸为色谱纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，16%→20%A；5～25 min，20%→85%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：236 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取苯甲酸对照品24.10 mg和羟苯乙酯对照品15.18 mg，分别加甲醇制成每1 mL含苯甲酸482.0 μg、羟苯乙酯303.6 μg的单一对照品贮备液。精密吸取上述两种单一对照品贮备液各适量，加甲醇制成每1 mL含苯甲酸64.27 μg、羟苯乙酯20.24 μg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密量取样品2 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按样品的处方比例和制备工艺制备无防腐剂的样品，再按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，各待测成分均能达到基线分离，分离度均＞1.5；理论板数以苯甲酸峰计为109 061，以羟苯乙酯峰计为192 418；保留时间分别为12.93、15.97 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 线性关系考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液 0.1、0.2、0.5、1、2 mL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以苯甲酸和羟苯乙酯质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得苯甲酸回归方程为y＝40.058 4x－0.045 6（r＝0.999 9）、羟苯乙酯回归方程为y＝19.196 5x+0.036 3（r＝0.999 8）。结果表明，苯甲酸和羟苯乙酯检测质量浓度线性范围分别为12.85～128.54、4.05～40.48 μg/mL。

2.5 定量限（LOQ）与检测限（LOD）考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得LOQ；当信噪比为3∶1时，得LOD。结果，苯甲酸和羟苯乙酯的LOQ分别为0.514、1.012 μg/mL，LOD分别为0.171 、0.353 μg/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，苯甲酸和羟苯乙酯峰面积的RSD分别为0.15%、0.17%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：1512026）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、18、30 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，苯甲酸和羟苯乙酯峰面积的RSD分别为0.17%、0.47%（n＝7），表明供试品溶液在室温下放置30 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取样品（批号：1512026）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，苯甲酸和羟苯乙酯含量的平均值分别为0.188%、0.046%，RSD分别为0.31%、0.98%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密量取样品（批号：1512026）1 mL，共6份，分别置于50 mL量瓶中，各加入一定质量的苯甲酸和羟苯乙酯对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。

2.10 样品中防腐剂含量测定

取5批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算防腐剂含量，结果见表2。

3 讨论

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

表2 样品防腐剂含量测定结果（n＝3，%）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，%）

3.1 流动相的选择

笔者参考相关文献[8-9]，考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.02%乙酸铵溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液作为流动相时对色谱分离的影响。结果，甲醇-水、乙腈-水为流动相进行梯度洗脱时，苯甲酸和羟苯乙酯有拖尾现象；以甲醇-0.02%乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱时，苯甲酸和羟苯乙酯的保留时间波动较大；以乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱时，苯甲酸和羟苯乙酯分离效果理想、峰形佳、理论板数高。故本试验选择乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱。

3.2 检测波长的选择

查阅相关文献[10-12]，苯甲酸和羟苯乙酯的检测波长不同。但在预试验中，笔者在200～400 nm波长范围内进行全波长扫面，发现苯甲酸和羟苯乙酯在236 nm波长处响应值均较高，且在此波长处无其他成分干扰，因此选择236 nm作为检测波长。

3.3 样品测定结果分析

2015年《中国药典》（四部）对合剂中防腐剂的用量作了规定，其中苯甲酸的用量不得超过0.3%（其钾盐、钠盐的用量分别按酸计），羟苯酯类的用量不得超过0.05%[13]，本试验样品中苯甲酸的含量为0.176%～0.188%、羟苯乙酯的含量为0.043%～0.046%，均未超出限定用量；但相比苯甲酸，羟苯乙酯的用量则需注意控制。

综上所述，本方法操作简单、结果准确，可用于安神补脑液中防腐剂的含量测定。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：884-885.

[2]谢兆辉，李学贵，许禔森.防腐剂苯甲酸（钠）测定方法的研究进展[J].粮食与油脂，2015，28（3）：6-10.

[3]王思文，巩江，高昂，等.防腐剂苯甲酸钠的药理及毒理学研究[J].安徽农业科学，2010，38（30）：16724、16846.

[4]陈龙浩，王雪荣，孙春玲，等.HPLC法测定盐酸丁卡因滴眼液中羟苯乙酯的含量[J].西北药学杂志，2015，30（2）：149-151.

[5]郭旭光.HPLC法同时测定水杨酸复合洗剂中苯甲酸和水杨酸的含量[J].中国药房，2014，25（28）：2667-2669.

[6]胡卫南.HPLC法测定强力枇杷露中苯甲酸钠的含量[J].中国药房，2016，27（9）：1257-1259.

[7]敬小丽，余蓉，李莉，等.高效液相色谱法测定饮料中苯甲酸、山梨酸钾[J].预防医学情报杂志，2017，33（3）：212-215.

[8]谷亦平，杨园，李霜，等.HPLC法同时测定马来酸噻吗洛尔滴眼液中噻吗洛尔和羟苯乙酯的含量[J].药物分析杂志，2017，37（1）：125-129.

[9]张留记，周志敏，屠万倩，等.反相高效液相色谱法测定牡丹皮中苯甲酸和苯甲酰基总苷[J].中南药学，2017，15（5）：671-673.

[10]田海燕，李智慧.HPLC法同时测定吡诺克辛钠滴眼液中不同抑菌剂的含量[J].中国药事，2017，31（2）：150-156.

[11]刘彦，倪美萍，刘睿思，等.中药口服液中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的中空纤维离心超滤-HPLC法测定[J].中国医药工业杂志，2017，48（5）：726-729.

[12]王帆.HPLC法测定罗红霉素颗粒中3种对羟基苯甲酸酯类防腐剂[J].海峡药学，2013，25（8）：80-82.

[13]国家药典委员会.中华人民共和国药典：四部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：26.

Content Determination of Antiseptics in Anshen Bunao Oral Liquid by HPLC

CHEN Lingjun1，WANG Faying2，WANG Weiying2（1.The Third Affiliated Hospital of Zhejiang University of TCM，Hangzhou 310005，China；2.Lishui Inspection Institute of Food and Drug ＆ Quality and Technology Inspection，Zhejiang Lishui 323000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of antiseptics in Anshen bunao oral liquid.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Agilent Zorbax SB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05%phosphorice acid solution（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 236 nm，and column temperature was 30 ℃.The injection volume was 10 μL.RESULTS：The linear range of benzoic acid and ethylparaben were 12.85-128.54 µg/mL（r＝0.999 9）and 4.05-40.48 µg/mL（r＝0.999 8），respectively.The limits of quantitation were 0.514，1.012 μg/mL.The limits of detection were 0.171，0.353 μg/mL.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 1.0%.The recoveries were 99.38%-100.21%（RSD＝0.31%，n＝6），97.96%-100.72%（RSD＝0.91%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate，and can be used for content determination of antiseptics in Anshen bunao oral liquid.

HPLC；Anshen bunao oral liquid；Antiseptics；Content

R927.2

A

1001-0408（2017）33-4722-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.31

浙江省公共科技条件平台项目（No.2012E60008）

＊中药师。研究方向：中药质量控制。电话：0571-87238002。E-mail：chen3952991@163.com

#通信作者：副主任中药师。研究方向：药物分析、药物质量控制。电话：0578-2661121。E-mail：onlyying0508@gmail.com

（编辑：刘 柳）

2017-07-02

2017-08-10）