花椒中生物碱测定方法及提取工艺研究

石雪萍

(江苏经贸职业技术学院 工程技术学院，南京 210007)

花椒中生物碱测定方法及提取工艺研究

石雪萍

(江苏经贸职业技术学院 工程技术学院，南京 210007)

采用乙醇水浴浸提法提取生物碱，电位滴定法测定生物碱含量。通过单因素试验确定了从花椒中提取生物碱的工艺参数的适宜范围，并进一步通过正交试验确定最佳提取工艺。结果表明：采用电位滴定法能够准确找到滴定终点，再根据酸碱反应可计算出生物碱含量。采用乙醇热浸提法通过单因素试验和正交试验研究了某品种花椒中总生物碱的提取工艺，乙醇热浸提最适宜的提取工艺条件为：采用体积分数为80%乙醇为提取剂，料液比为1∶10，浸提温度为70 ℃，浸提3 h，乙醇热浸提法提取生物碱的最佳提取率为2.11%。

花椒；生物碱；测定；提取工艺

花椒(学名：ZanthoxylumbungeanumMaxim.)，芸香科植物青椒或花椒的干燥成熟果实。花椒还是一味传统的中药，具有很多药用价值。可以温暖身体，去除寒气和湿气，保护胃和脾。可疏通肠胃，促进排尿、便，有利防治便秘；对女性生理期的疼痛也具有相当好的缓解作用；同时对驱虫杀虫、治疗高血压、糖尿病和心脏病都有一定的保护作用[1]。

花椒中的功能性成分主要包括花色苷(黄酮类)、生物碱、木质素、脂肪酸等。花椒本属类植物普遍都含有生物碱类[2]。国内外很多学者、研究者对花色苷及生物碱的结构、性质、功效进行了研究[3-5]。

生物碱是一类含氮的碱性有机化合物，有类似于碱的性质。大多数都有氮杂环结构，氮素多包含在环内，皆有显著的生物活性，是中草药中重要的有效成分之一，还具有光学活性[6]。生物碱的检测方法主要有酸性染料比色法[7]、电位滴定法[8]、紫外吸收法[9]等。提取方法主要有水提取法、氨-氯仿法、有机溶剂提取法、超声波提取法[10，11]等。

花椒中的生物碱是花椒呈现麻味的主要成分物质，目前诸多学者对花椒生物碱的提取测定产生了浓厚的兴趣。本实验采用电位滴定法测定花椒中生物碱，用乙醇热浸提法进行提取，正交试验优化提取工艺，旨在对花椒的进一步研究开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

花椒 南京市白下区石门坎苏果超市；奎宁(对照品) 上海纯优生物科技有限公司。

1.1.2 试剂

氢氧化钠、浓硫酸、乙醇、浓氨水、邻苯二甲酸氢钾等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-4数显恒温水浴锅 上海梅香仪器有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵 上海比朗仪器有限公司；干燥箱 南京实验仪器厂；PHS-3C电位滴定仪 上海佑科仪器仪表有限公司；电子天平 上海精密科学仪器有限公司；高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 样品前处理

花椒放入烘箱中进行干燥，再将干燥后的花椒放入豆浆料理机中，粉碎至过40～60目筛，密封包装后置于阴凉干燥处备用。

取样品适量，用20倍石油醚进行脱脂处理。萃取3次，每次12 h。抽滤，取滤渣，风干备用。

2.2 溶液的配制及标定

2.2.1 溶液配制

0.02 mol/L H2SO4：取2 mL 98%浓硫酸, 定容至1000 mL，即得。

0.04 mol/L NaOH：取1.6 g NaOH粉末，溶于蒸馏水中，定容至1000 mL，即得。

2.2.2 溶液标定

2.2.2.1 NaOH溶液浓度的标定

准确称取0.1～0.125 g邻苯二甲酸氢钾(KHP)3份，分别于250 mL的锥形瓶中，加入50 mL的水使之溶解。再加酚酞指示剂2滴，用待标定的NaOH溶液滴定至溶液呈微红色，30 s不褪色，即为终点。记录所用NaOH溶液体积，计算NaOH标准溶液的浓度，并用Q检验法检验所得结果，最后计算结果的平均值和相对平均偏差。相对平均偏差应不超过0.2%，见表1。

表1 NaOH溶液浓度的标定Table 1 The calibration of NaOH solution concentration

公式：CNaOH=[mKHP/(M×V)]×1000，M=204.2 g/mol。

2.2.2.2 H2SO4溶液浓度的标定

用已标定的NaOH溶液进行标定，取3支锥形瓶，分别加入10 mL已标定的浓度为0.378 mol/L的NaOH溶液，再加入2滴甲基橙，用待标定的H2SO4溶液进行滴定至溶液由黄色变为橙色，即为终点，见表2。

表2 H2SO4溶液浓度的标定Table 2 The calibration of H2SO4 solution concentration

2.3 电位滴定法测定生物碱含量

2.3.1 花椒中生物碱的提取

称取1 g干的花椒粉于锥形瓶中，加入20倍的70%乙醇，密封，称重计数，于60 ℃恒温水浴中浸提2 h；取出称重，加乙醇至恒重；抽滤3次，取滤液；得到生物碱的抽滤液。

2.3.2 花椒中生物碱的测定

取上述待测滤液10 mL，加入20 mL已标定的H2SO4，将复合玻璃电极插入溶液中，选择“mV”模式，开动搅拌器，用已标定的NaOH滴定，记录电动势mV变化和对应NaOH消耗量，仪器以mV值突跃判定滴定终点。将电动势对NaOH消耗的体积作图，再对电动势求一阶导数，一阶导数对体积作图，峰尖对应的值即是滴定终点[12]。电位滴定图见图1。

图1 电位滴定图Fig.1 Potentiometric titration

根据酸碱中和推出计算公式：生物碱含量(%)=[(CH2SO4×VH2SO4×2-CNaOH×VNaOH)/样品质量]×M×100%， 即可求得生物碱的含量。

式中：CH2SO4为H2SO4浓度，mol/L；VH2SO4为H2SO4体积，L； CNaOH为NaOH浓度，mol/L；VNaOH为消耗NaOH的体积，L；M为花椒的生物碱(青花椒碱)相对分子量，257 g/mol。

由图1可知，突跃点的NaOH消耗量为19.3 mL，则根据公式可以计算得：生物碱含量(%)=[(0.0193×0.02×2-0.0378×0.0193)/1]×257=1.09%。

因此，在料液比为1∶20，乙醇浓度为70%，提取温度为60 ℃下提取3 h时的花椒中生物碱的含量为1.09%。

2.4 生物碱提取条件的优化

2.4.1 单因素试验

综合对各种资料及文献的参考及考虑，初步确定了影响花椒生物碱提取得率的4个重要因素，包括乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度。为了获得每个因素的最佳工艺条件，必须先进行单因素试验，固定其中3个因素不变，然后适当改变剩下1个因素的取值，在不同条件下进行试验，并通过记录数据，分析数据，作图计算出生物碱的提取得率。根据生物碱的不同提取得率，便可以得到每个因素的最佳条件，由于各提取条件对生物碱的提取得率都有很大的影响，为了测定每个因素单独对提取得率的不同影响，进行4组单因素试验。

2.4.1.1 提取温度对花椒中生物碱提取得率的影响

分别称取1 g花椒4份，加入到250 mL的三角瓶里，加入20倍体积的70%乙醇，在60，70，80，90 ℃不同温度下提取2 h，取出提取液，按照2.3.2方法测定生物碱的含量。记录数据，作图比较。

图2 提取温度对花椒中生物碱提取得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on alkaloid extraction yield of Zanthoxylum bungeanum

由图2可知，在60～70 ℃之间随着温度的增加花椒中生物碱的提取得率也增加，但是超过70 ℃后花椒中生物碱的提取得率逐渐减少，尤其在80 ℃后提取得率明显降低。所以确定选用60，70，80 ℃作为正交试验的该因素3个水平。

2.4.1.2 乙醇浓度对花椒中生物碱提取得率的影响

分别称取1 g花椒4份，加入到250 mL的三角瓶里，加入20倍体积浓度为60%，70%，80%，90%的乙醇，分别在70 ℃下提取2 h，取出提取液，按照2.3.2方法测定生物碱的含量。记录数据，作图比较。

图3 乙醇浓度对花椒中生物碱提取得率的影响Fig.3 Effect of different ethanol concentration on alkaloid extraction yield of Zanthoxylum bungeanum

由图3可知，乙醇浓度对花椒总生物碱的提取率影响显著。乙醇浓度过高或过低总生物碱的提取得率都会降低，当体积分数为70%时，提取率可高达1.61%，因此选择70%，80%，90%乙醇作为正交试验乙醇体积分数的3个水平。

2.4.1.3 提取时间对花椒中生物碱提取得率的影响

分别称取1 g花椒4份，加入到250 mL的三角瓶里，加入20倍体积70%的乙醇，在70 ℃下分别提取1.5，2，2.5，3 h，取出提取液，按照2.2.3方法测定生物碱的含量。记录数据， 作图比较。

图4 提取时间对花椒中生物碱提取得率的影响Fig.4 Effect of different extraction time on alkaloid extraction yield of Zanthoxylum bungeanum

由图4可知，提取时间延长生物碱的提取得率增大，最大可达1.70%，因为天然产物提取过程中提取时间的正确掌控对提取效果有重要影响，溶出平衡之前，随时间延长溶出率增大。

2.4.1.4 料液比对花椒中生物碱提取得率的影响

分别称取1 g花椒4份，加入到250 mL的三角瓶里，分别加入10，20，30，40倍体积的70%乙醇，在70 ℃下提取2 h，取出提取液，按照2.3.2方法测定生物碱的含量。记录数据，作图比较。

图5 料液比对花椒中生物碱提取得率的影响Fig.5 Effect of material-liquid ratio on alkaloid extraction yield of Zanthoxylum bungeanum

由图5可知，随料液比的增大总生物碱的提取得率也增大，当料液比为1∶20时提取得率可高达1.61%，料液比为1∶20与1∶30的提取得率差异不大，说明1∶30的料液比就可以把生物碱基本提取完全。并且考虑到溶剂用量大、回收困难、节省成本的因素，因此选择1∶10，1∶20，1∶30的料液比作为正交试验料液比因素的3个水平。

2.4.2 正交试验

在单因素基础上，设计以下正交试验。分别称取1 g花椒9份，加入到已编号的9支250 mL三角瓶中，按照四因素三水平进行添加及条件控制。按照2.3.2方法测定生物碱的含量，记录数据。

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experiment

由表3可知，最佳提取条件为B1A2C3D1，即在料液比为1∶10、乙醇浓度为80%、提取温度为70 ℃、提取时间为3 h的条件下，对花椒的提取率最大，由极差分析可以看出，料液比为影响提取得率的重要因素，而提取温度影响最小。

3 验证试验

通过正交试验得到了生物碱的最优工艺，为了验证最优组合的正确性，试验在得到的最佳提取组合条件下，即在提取温度70 ℃，乙醇体积分数为80%，提取时间3 h，料液比为1∶10的条件下重复试验3次，进行验证试验。试验数据见表4，验证试验的平均提取率为2.11%，与7号组合基本一致，说明了优化试验的合理性。

表4 验证试验结果Table 4 Results of verification experiment

4 结论

本研究采用热浸提法提取花椒中的生物碱，并通过电位滴定法测定生物碱的含量。通过单因素试验和正交试验，确定了影响生物碱提取得率因素的主次顺序，以及各项因素的最佳条件，并最终确定了提取的最佳工艺。通过正交试验，生物碱的最佳提取条件为乙醇浓度80%、料液比1∶10、提取温度70 ℃、提取时间3 h，在此条件下花椒中生物碱提取得率为2.11%。

通过对花椒中花色苷、生物碱的提取工艺进行研究，可为花椒进一步的药理作用研究提供一定的理论依据。

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StudyonDeterminationMethodandExtractionTechnologyofZanthoxylumbungeanumAlkaloids

SHI Xue-ping

(School of Engineering and Technology,Jiangsu Vocational Institute of Commerce,Nanjing 210007,China)

The alkaloids are extracted by ethanol-water extraction and the content of alkaloids is determined by potentiometric titration. Through the single factor experiment, the optimum technological parameters for extracting alkaloids fromZanthoxylumbungeanumare determined, and the optimum extraction process is determined by orthogonal test.The results show that using the method of potentiometric titration, it is easy to find the titration end point. According to acid-base reaction, the content of alkaloid could be calculated. Using ethanol heating extraction method, the extraction technology of total alkaloids fromZanthoxylumbungeanumis studied by single factor experiment and orthogonal experiment.The optimum extraction conditions are:using 80% ethanol as extractant, material-liquid ratio is 1∶10, extraction temperature is 70 ℃, extraction time is 3 h.The optimum extraction rate of alkaloids by ethanol heating extraction method is 2.11%.

Zanthoxylumbungeanum;alkaloid;determination;extraction technology

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.022

1000-9973(2017)12-0101-05

2017-06-21

江苏省自然科学基金面上项目(SBK201620404)

石雪萍(1974-)，女，河南南阳人，副研究员，研究方向：食品营养与检测、功能性食品研究与开发。