香旱芹精油对金黄色葡萄球菌抑菌机理的研究

黄巍，王建清，张倩

(1.天津科技大学 中国轻工业食品包装材料与技术重点实验室，天津 300222；2.中国包装科研测试中心，天津 300457)

香旱芹精油对金黄色葡萄球菌抑菌机理的研究

黄巍1,2，王建清1，张倩1

(1.天津科技大学 中国轻工业食品包装材料与技术重点实验室，天津 300222；2.中国包装科研测试中心，天津 300457)

采用微波辅助水蒸气蒸馏提取出香旱芹精油，对其成分进行GC-MS分析，通过测试其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径、最低抑菌浓度(MIC) 和最低杀菌浓度(MBC) 评价其抑菌效果。分别从菌体微观形态、细胞溶出物、蛋白质和钾离子泄漏等方面研究香旱芹精油对金黄色葡萄球菌的抑菌机理。实验结果表明香旱芹精油的主要成分为百里香酚(45.85%)、对伞花烃(20.72%)和γ-松油烯(23.57%)，其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为75 mm，MIC为0.25 μL/mL，MBC为0.5 μL/mL。香旱芹精油可使金黄色葡萄球菌细胞膜受到损伤，使细胞膜表面出现塌陷和破裂，并引起菌体细胞溶出物、蛋白质以及钾离子的泄露，从而导致菌体的死亡。

香旱芹精油；微波辅助水蒸气蒸馏；GC-MS分析；金黄色葡萄球菌；抑菌机理

随着人们对食品安全的关注程度日渐提升，传统的化学防腐剂处理生鲜农产品来延长其货架寿命由于化学防腐剂的残留和迁移问题对人体健康造成很大的安全隐患[1]，因此开发安全，高效可以代替传统化学防腐剂的绿色天然抗菌剂成为人们日益关心的问题。近年来的一些研究成果表明：植物源抗菌剂对食源性致病菌具有广谱抑菌效果[2,3]。

香旱芹又名印度藏茴香，现主要分布在中亚、印度和我国新疆和田地区。香旱芹在印度主要用作一种烹饪调料，在我国是一种藏药成分，用于风湿性关节炎和腹泻等的治疗。香旱芹精油在国外的文献中有初步报道它的抑菌效果[4]，它是如何实现抑菌和杀菌功能，特别是作用靶向部位的确定目前还不清楚。本文以金黄色葡萄球菌为供试菌，从细胞膜结构形态变化、细胞溶出物泄漏、蛋白质释放、钾离子释放等方面研究香旱芹精油对其的抑菌机理，为开发绿色安全的植物源防腐保鲜剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

香旱芹果实：原产地印度，网上采购。

实验菌种：金黄色葡萄球菌，由天津科技大学菌种保藏中心提供。

1.2 主要仪器设备

UV-2700 紫外可见分光光度计 日本岛津公司；PinAAcle 900T原子吸收光谱仪 美国PerkinElmer公司； SU-1510 扫描式电子显微镜 日本日立公司；Varian 4000MS GC-MS气相色谱质谱联用仪 美国瓦里安公司； CHA-SA气浴恒温振荡器 普瑞斯机械有限公司；全自动高压灭菌锅 上海博迅实业有限公司；H-1650高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司； SW-CJ-2F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；DHP-9052电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司; ORW1.5S-3E微波动态萃取设备 南京澳润微波科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 微波辅助水蒸气蒸馏提取香旱芹精油

准确称取100.0 g香旱芹果实粉末与蒸馏水按1∶20的料液比混合，置于微波动态萃取设备料桶中，微波功率为600 W，温度设为105 ℃，在微波萃取设备上接挥发油提取器，待提取结束后，收集蒸馏出的精油，无水硫酸钠脱水，称量，计算提取率。

1.3.2 抑菌效果测试

1.3.2.1 抑菌圈测试

参考张赟彬等[5]的方法，采用滤纸片扩散法测试抑菌圈直径。向直径为90 mm的无菌培养皿中导入15 mL已灭菌的营养琼脂培养基，待其凝固后，加入100 μL浓度为 1×107cfu/mL的菌悬液，无菌涂布棒均匀涂布。在培养皿中央放置1个直径为6 mm的无菌滤纸片，在滤纸片上添加10 μL香旱芹精油。将培养皿置于培养箱中 37 ℃培养 24 h后测试抑菌圈直径。以空白无菌滤纸片作为对照组。

1.3.2.2 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)测试

采用对倍稀释法用无菌营养肉汤将香旱芹精油稀释成一系列的浓度，每支试管中营养肉汤和香旱芹精油混合液的体积为10 mL，然后加入50 μL菌液。将试管置于37 ℃，120 r/min 摇床培养 24 h。上述试管中肉眼观察到的未浑浊的最低浓度为最低抑菌浓度(MIC)。从未浑浊的试管中取出50 μL菌液涂布于营养琼脂培养基之上，37 ℃继续培养 24 h之后培养皿中无细菌生长的最低浓度为最低杀菌浓度(MBC)。

1.3.3 精油的GC-MS分析

参考丁华等[6]的实验方法并稍做修改。

气相色谱条件：柱子型号VF-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度300 ℃，柱子流速1 mL/min，载气He；程序升温：初始温度60 ℃，先以5 ℃/min升到200 ℃，再以10 ℃/min升到300 ℃，保持3 min。

质谱条件：质量分析器为离子阱，阱温220 ℃，传输线温度280 ℃，扫描方式为full/SIS，扫描范围43～500 amu。

取精油用色谱级正己烷稀释1000倍，取0.4 μL进样。检索NIST 10标准质谱库，结合有关文献确认精油的各个化学成分。按面积归一化法计算各成分含量。

1.3.4 抑菌机理测试

1.3.4.1 扫描电镜(SEM)观察菌体结构

采用扫描电子显微镜(SEM)观察精油对金黄色葡萄球菌细胞形态的影响，参考Han等[7]的方法并做适当修改。将金黄色葡萄球菌的菌悬液培养至生长对数期，调节其浓度为1×108cfu/mL。将香旱芹精油以3种不同浓度[0(对照组)，1MIC和2MIC]加入到调节完浓度的菌悬液中，将加完精油的菌悬液置于摇床中培养。37 ℃培养1 h后，从每份试样中取出2 mL细菌悬浮液，以3000 r/min的转速离心10 min。 然后将收集的细胞用50%水/乙醇溶液洗涤2次。然后将20 μL悬浮液涂布在盖玻片(1 cm×1 cm)上，并将100 μL含有体积分数为2.5%的戊二醛溶液(用磷酸盐缓冲液稀释)加入到盖玻片上固定2～3 h，然后进行喷金和SEM观察。

1.3.4.2 细胞溶出物泄漏测试

参考Turgis等[8]的方法并进行适当修改，对菌悬液的上清液中的细胞溶出物进行测试。菌种活化及菌悬液制备的操作方法同1.3.4.1。将菌悬液以4000 r/min离心15 min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次，然后重悬于初始体积的无菌生理盐水中。 将体积为25 mL的细菌悬浮液的等分试样分别加入3种浓度的精油[0(对照组)，1MIC和2MIC]，在气浴恒温振荡器中37 ℃培养。分别在0，1，2 h将混合物以4000 r/min离心15 min，使用UV-可见分光光度计在260 nm波长条件下测量3 mL上清液的吸光度值。

1.3.4.3 蛋白质泄漏测试

参考He Mengying等[9]的方法测试细胞内蛋白质泄漏，并做适当修改。通过测试细菌悬浮液上清液的蛋白质含量进行蛋白质泄漏测试。使用考马斯亮蓝法和紫外可见分光光度计在595 nm测定上清液中蛋白质的含量。 从标准牛血清白蛋白曲线计算释放的蛋白质的量。

1.3.4.4 钾离子泄漏测试

参考Miao等[10]的方法并做适当修改，测量细菌悬浮液上清液中钾离子的浓度。将培养至对数生长期的540 mL菌悬液以4000 r/min离心15 min收集菌体，然后用无菌生理盐水溶液(0.85%光谱纯NaCl，超纯水稀释)洗涤3次，重悬于540 mL无菌生理盐水中，分成60 mL等分试样9份。将悬浮液等分试样加入3种不同浓度[0(对照组)，1MIC和2MIC]的香旱芹精油在摇床中37 ℃培养。在0，0.5，1，2，3，4 h分别取出10 mL样品以4000 r/min离心15 min，收集1 mL上清液。用超纯水将1 mL样品稀释10倍。使用原子吸收分光光度计测量上清液的钾离子浓度。

1.3.5 数据的统计分析

采用Excel 2007进行实验图表的绘制，采用SPSS 17.0软件中的T检验和ANOVA进行显著性分析，当P<0.05时，认为存在显著差异。

2 实验结果与讨论

2.1 香旱芹精油的化学成分分析

经过微波辅助水蒸气蒸馏提取的香旱芹精油的得率为4.4%。香旱芹精油的GC气相色谱图见图1。

图1 香旱芹精油的气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of ajowan essential oil

通过 GC-MS 计算机检索、人工解析谱图与标准质谱对比，并参考相关文献[11,12]，对谱图进行解析，最终鉴定出了16种成分，占总量的97.18%，其中香旱芹精油的主要成分为百里香酚45.85%，对伞花烃20.72%，γ-松油烯23.57%，β-蒎烯4.53%，丁香酚0.7%，本实验提取的香旱芹精油主要成分与参考文献比较接近。

2.2 香旱芹精油的抑菌效果

香旱芹精油对经金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为75 mm，抑菌圈直径的抗菌效力一般可以分为3个水平[13]：强抑菌活性：抑菌圈直径≥20 mm；中等抑菌活性：12 mm<抑菌圈直径<20 mm；弱抑菌活性：抑菌圈直径≤12 mm。香旱芹精油75 mm的抑菌圈直径显著地高于一般抗菌剂的抑菌圈直径评价标准，这说明它具有超强的抑菌能力。香旱芹精油的MIC为0.25 μL/mL，MBC为0.5 μL/mL，较低浓度的MIC和MBC也证实了其对金黄色葡萄球菌的强抑制作用。

2.3 香旱芹精油对金黄色葡萄球菌的抑菌机理分析

2.3.1 香旱芹对细菌细胞膜形态变化的影响

图2 经香旱芹精油处理1 h后的金黄色葡萄球菌扫描电镜图片Fig.2 The SEM pictures of Staphylococcus aureus treated with ajowan essential oil for 1 h

图2(a)为未经过香旱芹精油处理的金黄色葡萄球菌的SEM图片，未经香旱芹精油处理的金黄色葡萄球菌细胞显示圆球状，细胞结构完整且表面光滑。图2(b)是经1MIC香旱芹精油处理60 min后的金黄色葡萄球菌的SEM图片，部分金黄色葡萄球菌细胞膜受到损伤，细胞膜表面出现了褶皱和局部塌陷。图2(c)是经过2MIC香旱芹精油处理60 min后的金黄色葡萄球菌的SEM图片，与经过IMIC处理过的金黄色葡萄球菌相比，随着精油浓度的增加，2MIC香旱芹精油对金黄色葡萄球菌细胞膜的破坏程度更大，细胞的塌陷和破裂变得更加严重。Shi Ce等[14]报道了nisin与肉桂醛协同作用改变了金黄色葡萄球菌的外部结构并导致细胞壁退化和高度的细胞裂解。本文观察到的经香旱芹精油处理过的金黄色葡萄球菌的细胞发生了与上述文献中类似的情况。

2.3.2 香旱芹精油对金黄色葡萄球菌细胞溶出物释放的影响

在260 nm处吸收的物质包括蛋白质和核酸，上清液在260 nm的光密度值是细胞膜破裂和内部细胞成分释放的指示[15]。不同浓度的香旱芹精油处理金黄色葡萄球菌0，1，2 h后OD260值见图3。

图3 不同浓度的香旱芹精油对金黄色葡萄球菌细胞溶出物的影响Fig.3 The effect of different concentration of ajowan essential oil on the release of cell constituents from S. aureus

与未加入香旱芹精油的对照组相比，随着时间和精油浓度的增加，260 nm的光密度值增加。精油作用2 h后，用2MIC 香旱芹精油处理的大肠杆菌细胞观察到的最大OD260为0.556，用1MIC香旱芹精油处理的细胞的最大OD260为0.258，而此时对照组的OD260值仅为 0.071，可见香旱芹精油可以显著增加金黄色葡萄球菌细胞溶出物的释放(P<0.05)。Shen Suxia等[16]在研究中发现金黄色葡萄球菌经过1MIC的肉桂醛处理后，其在260 nm下的吸光度值明显增加，并且当肉桂醛的浓度增加至4MIC时，其OD260继续增加。Ajiboye T O等[17]发现丁香提取物同样也造成了金黄色葡萄球菌菌悬液中260 nm波长下的吸光度值的上升，并且这一现象随着丁香提取物浓度的增加变得更加明显。本文实验结果与上述实验现象相吻合，这说明香旱芹精油可以造成金黄色葡萄球菌的细胞溶出物的泄漏。

2.3.3 香旱芹精油对金黄色葡萄球菌蛋白质释放的影响

不同浓度的香旱芹精油对金黄色葡萄球菌蛋白质释放的影响见表1。

表1 不同浓度的香旱芹精油对金黄色葡萄球菌蛋白质释放的影响Table 1 The effect of different concentration of ajowan essential oil on the release of protein from S. aureus mg/L

用1MIC 香旱芹精油处理的金黄色葡萄球菌溶液的上清液中的蛋白质浓度比对照中有显著提升(P<0.05)。处理1 h后，对照组中的蛋白质释放仅为1.79 mg/L，而用1MIC和2MIC香旱芹精油处理的金黄色葡萄球菌样品中，其分别为4.03 mg/L和5.97 mg/L。刘笑宇也报道了肉桂精油处理可以明显增加金黄色葡萄球菌的蛋白质泄漏量[18]。这说明香旱芹精油可以造成金黄色葡萄球菌细胞中蛋白质的泄漏，这一现象随着精油浓度的增加破坏作用更明显。

2.3.4 香旱芹精油对金黄色葡萄球菌钾离子释放的影响

香旱芹精油对膜功能的影响之前已通过测定细胞溶出物和蛋白质的渗漏来评价。当微生物暴露于抗生素或一些其他不适当的生长环境时，微生物细胞膜被破坏，并且细胞膜的渗透性变化可能导致电解质例如钾离子从细胞内部泄漏。因此，钾离子释放测定法是研究抗微生物活性的有用手段，在本实验中通过对钾离子释放量的测试用于进一步评价抗菌剂对金黄色葡萄球菌细胞膜的影响。

3种不同浓度[0(对照组)，1MIC和2MIC]的香旱芹精油处理对金黄色葡萄球菌细胞释放的钾离子的影响结果见图4。

图4 香旱芹精油对金黄色葡萄球菌钾离子释放的影响Fig.4 The effect of ajowan essential oil on the release of potassium ions from S. aureus

在对照组中，金黄色葡萄球菌悬浮液中钾离子的细胞外浓度随时间缓慢升高，4 h后达到0.32 mg/L。用香旱芹精油处理的金黄色葡萄球菌悬浮液中的钾离子的细胞外浓度显着高于对照组(P<0.05)，并随时间增加而缓慢增大。用1MIC香旱芹精油处理的细菌悬浮液中的钾离子浓度在4 h后分别达到最大值1.22 mg/L，显著高于对照组(P<0.05)；当香旱芹精油的浓度上升到2MIC时，菌悬液中钾离子浓度达到1.35 mg/L，显著高于对照组(P<0.05)。Vivek K Bajpai[19]也得到了与本实验类似的结论，发现枸杞果实精油可以破坏金黄色葡萄球菌细胞膜的阻隔性，导致钾离子泄漏的增加。

3 结论

本文采用微波辅助水蒸气蒸馏提取出了香旱芹精油，提取得率为4.4%，其主要成分为百里香酚(45.85%)、对伞花烃(20.72%) 和γ-松油烯(23.57%)。香旱芹精油对金黄色葡萄球菌具有强抑制作用，抑菌圈直径为75 mm，MIC为0.25 μL/mL，MBC为0.5 μL/mL。香旱芹精油对金黄色葡萄球菌的抑菌作用方式在于破坏了金黄色葡萄球菌细胞膜的结构，使细胞膜表面出现塌陷和破裂，并引起了金黄色葡萄球菌细胞溶出物、蛋白质以及钾离子的泄露和释放，从而最终导致了菌体的死亡。

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StudyontheAntibacterialMechanismofAjowanEssentialOilAgainstStaphylococcusaureus

HUANG Wei1,2, WANG Jian-qing1, ZHANG Qian1

(1.China Light Industry Key Laboratory of Food Packaging Materials and Technology, Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300222,China;2.China Packaging Research & Test Center,Tianjin 300457,China)

Ajowan essential oil is extracted by microwave assisted steam distillation, and its chemical composition is analyzed by GC-MS.The inhibitory diameter,minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of ajowan essential oil againstStaphylococcusaureusare tested by agar diffusion method and dilution method.The antibacterial mechanism of ajowan essential oil againstS.aureusis studied by exploring the scanning electron microscopy (SEM) image ofS.aureus, the leakage of cell constituents, protein and potassium ion.The results show that the main components of ajowan essential oil are thymol (45.85%),p-cymene( 20.72%) and γ-terpinene(23.57%), which have a strong inhibitory effect onS.aureus,the diameter of inhibition zone is 75 mm, the MIC is 0.25 μL/mL and the MBC is 0.5 μL/mL. Ajowan essential oil can destroy the cell membrane ofS.aureus, and its cell membrane surface appears folds and local collapse, resulting in the leakage of cell constituents, protein and potassium ion,leading to the death of bacteria.

ajowan essential oil;microwave assisted steam distillation;GC-MS analysis;Staphylococcusaureus;antibacterial mechanism

TS201.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.002

1000-9973(2017)12-0007-05

2017-06-23

“十二五”国家科技支撑计划项目(2015BAD16B05-02)

黄巍(1982-)，男，湖南株洲人，博士，研究方向：农产品绿色防腐保鲜技术和运输包装技术。