用UPLC 法测定银黄含片中8种活性成分含量的效果研究

于海波

（徐州市食品药品监督检验中心，江苏 徐州 221006）

用UPLC 法测定银黄含片中8种活性成分含量的效果研究

于海波

（徐州市食品药品监督检验中心，江苏 徐州 221006）

目的：研究用UPLC法测定银黄含片中8种活性成分含量的效果，以期为该药的质量控制研究提供参考依据。方法：采用UPLC法对银黄含片中绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、黄芩苷、木犀草素、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量进行测定。结果：银黄含片中8种活性成分的线性关系良好，相关系数均＞0.9997，加样回收率均在97.3%～102.0%之间，RSD均小于1.2%。结论：用UPLC法测定银黄含片中8种活性成分含量的效果好。可采用该方法对银黄含片进行全面、有效的质量控制。

超高效液相；银黄含片；活性成分；含量测定

银黄含片收载于《国家药品标准》新药转正第16～第26册。该药是由金银花和黄芩的提取物制备而成的。临床上主要用该药治疗由外感风热、肺胃热盛所致的咽干、喉痛、急慢性扁桃体炎、急慢性咽炎及上呼吸道感染等病症[1]。有研究结果显示，金银花中含有的酚酸类及黄酮类化合物（如绿原酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷等）是银黄含片中的主要活性成分[2]。黄芩中含有的黄酮类化合物（如黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等）是银黄含片产生药效的主要成分[3]。现行的银黄含片质量控制方法（采用HPLC法对银黄含片中一类或几类成分的含量进行测定）仅可对其中的绿原酸和黄芩苷进行含量测定及质量控制，所得的结果比较单一，故难以全面地评估该药的整体质量[4-8]。在本次研究中，笔者采用UPLC法对银黄含片中8种活性成分（包括绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、黄芩苷、木犀草素、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素）的含量进行测定，以期为银黄含片的质量控制研究提供科学的参考依据。

1 仪器与试剂

1）仪器：Waters UPLC H-class超高效液相色谱仪（生产厂家：美国Waters公司）、XS205电子天平（精度：十万分之一，生产厂家：瑞士梅特勒-托利多公司）。2）试剂：绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、黄芩苷、木犀草素、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的对照品均购自中国药品生物制品检定所，其纯度均≥98.0%。银黄含片（含5个批次）均购自药店，其生产厂家分别为成都地奥制药集团有限公司（A、B批次）、上海信宜天平药业有限公司（C、D批次）、鲁南厚普制药有限公司（E批次）。其中，使用A批次的银黄含片进行方法学研究。色谱纯为乙腈、甲醇。分析纯为甲酸、乙酸。实验用水为纯化水。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色 谱 柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）。梯度洗脱：A：0～ 1.5 min，15%；1.5～ 2.7 min，15% ～ 22%；2.7～ 4.0 min，22% ～ 30%；4.0～ 5.2 min，30%～40%；5.2～8.0 min，40%～55%；8.0～10.0 min，45% ～ 55%。 流速 ：0.4 ml·min-1。 柱温 ：30℃。检测波长：320 nm。进样量：5 μL。

2.2 供试品溶液的制备方法

取银黄含片，将其研成细粉。精密称取0.5 g的银黄含片细粉，将其置于50 ml的量瓶中，然后向量瓶中加入40 ml浓度为50%的甲醇。用超声对该混合溶液进行30 min的提取后，将提取液放冷，用浓度为50%的甲醇将其稀释至刻度后摇匀、滤过，将续滤液在进样前用0.22 μm的微孔滤膜进行过滤，得到供试品溶液。

2.3 对照品储备液的制备方法

精密称取适量的绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、黄芩苷、木犀草素、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品。用甲醇将上述的对照品配制成浓度为 1 mg·mL-1的对照品储备液，然后将该储备液放入4 ℃的冰箱中保存。

2.4 进行系统适用性试验

分别准确称取2.3中的8种对照品储备液，用甲醇对其进行稀释，得到含绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、黄芩苷、木犀草素、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的混合对照品溶液。这8种混合对照品溶液的浓度分别为10.00μg/ml、10.00μg/ml、20.00μg/ml、100.00μg/ml、10.00μg/ml、20.00μg/ml、20.00μg/ml、10.00 μg/ml。分别取混合对照品溶液、供试品溶液，按照2.1中的色谱条件对其进行分析，得到银黄含片中8种活性成分混合对照品、供试品的色谱图（见图1）。银黄含片样品中8种被检测成分的峰与相邻峰的分离度R＞1.5，理论板数均＞5000。

图1 银黄含片中8种活性成分的UPLC色谱图

2.5 进行线性关系考察

精密吸取2.3中的对照品储备液，将其逐级稀释成不同浓度的对照品溶液，对这些溶液进行进样测定。以浓度x（μg/ml）对峰面积y进行线性回归分析，按2.1的条件进行测定。结果表明，银黄含片中的8种活性成分具有良好的线性关系。详见表1。

表1 银黄含片中8种活性成分的线性回归方程、相关系数和线性范围 （n=3）

2.6 进行精密度试验

精密吸取同一批次银黄含片的供试品溶液5 μl，连续进样6次，计算其峰面积的RSD（n=6）。计算结果显示，绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、黄芩苷、木犀草素、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD分别为0.55%、0.21%、0.37%、0.29%、0.41%、0.82%、0.33%、0.70%。这一计算结果表明，本次试验所用仪器的精密度良好。

2.7 进行重复性试验

按2.2中的方法制备6份供试品溶液，按2.1中的色谱条件对这6份供试品溶液进行测定。结果显示，这6分供试品溶液中绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、黄芩苷、木犀草素、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的平均含量分别为2.135、0.116、0.527、21.365、3.657、0.521、0.436、0.098 mg/g， 其 RSD分别为0.87%、1.10%、0.63%、0.58%、1.20%、0.81%、1.13%、1.42%。这一测定结果表明，本次试验所用方法的重复性良好。

2.8 进行稳定性试验

精密称取0.5 g的银黄含片细粉，按2.2中的方法制备供试品溶液，再按2.1中的色谱条件分别在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h对该供试品溶液进行进样5 μl测定。 结果显示，该供试品溶液中绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、黄芩苷、木犀草素、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.11%、1.06%、0.96%、0.32%、1.27%、0.47%、1.05%、1.11%。这一测定结果表明，该供试品溶液在室温条件下放置24 h的稳定性良好。

2.9 进行加样回收率试验

取9份已知含量的银黄含片细粉，每份的重量均为0.25 g。在这9份银黄含片细粉中分别加入适量的对照品溶液，按2.2中的方法将其制备成供试品溶液，然后按2.1中的色谱条件对新制备的供试品溶液进行进样分析，并计算其加样回收率。详见表2。

2.10 进行样品含量测定

分别精密称取由不同厂家生产的5个批次的银黄含片细粉0.5 g，按2.2中的方法制备供试品溶液，并对该供试品溶液进行测定。具体的测定结果见表3。从该测定结果可以看出，不同厂家生产的银黄含片中8种活性成分含量的差异较大。同一厂家生产的不同批次银黄含片中8种活性成分的含量也存在差异。对银黄含片中的单一成分进行质量控制无法全面地反映该药品整体的质量。这一测定结果提示对中药制剂进行多组分质量控制的必要性。

表2 对银黄含片中8种活性成分进行加样回收率试验的结果

表3 对5个批次银黄含片中8种活性成分含量进行测定的结果 （mg/g，mean±S，n=3）

3 讨论

在进行本次试验前，笔者参考了相关的文献，并对乙腈、甲醇两种洗脱剂进行对比后认为，乙腈的峰形更好、分离效率更高。在乙腈中加入少量的甲酸可有效改善色谱的峰形。因此，将本次试验的流动相组成确定为乙腈（A）和0.1%甲酸水（B）溶液。同时，通过对梯度洗脱程序进行优化，将最终的洗脱程序确定为A：0～1.5 min，15%；1.5～2.7 min，15%～22%；2.7～4.0 min，22%～30%；4.0～5.2 min，30%～40%；5.2～8.0 min，40%～55%；8.0～10.0 min，45%～55%。

在进行本次试验的过程中，笔者利用二极管阵列检测器在190～400 nm的波长范围内对银黄含片中的8种活性成分进行紫外光谱扫描。结果表明，绿原酸、咖啡酸在320 nm波长时的吸收最大，木犀草苷和木犀草素在350 nm波长时的吸收最大，黄芩苷和汉黄芩苷在275 nm、320 nm波长处均有吸收峰，黄芩素和汉黄芩素在275nm波长处均有最大吸收、在320 nm波长处均有肩峰。因此，为了确保每种活性成分均有较好的响应，本次试验选择320 nm波长作为检测波长。

综上所述，用UPLC法测定银黄含片中8种活性成分含量的效果理想，而且具有操作简便、快速、分离效果好等优点。可采用该方法对银黄含片进行全面、有效的质量控制。

[1]国家药典委员会.国家药品标准(新药转正标准第64册)[M].北京:人民卫生出版社,2008:96-97.

[2]李小芩,孙晓红,蔡爽,等.采用UPLC-ESI-MS/MS以及主成分聚类分析研究不同品种金银花的化学成分及其差异[J].药学学报,2009,44(8):895-904.

[3]HAN J, YE M, XU M,et al.Characterization of flavonoids in the traditional Chinese herbal medicine-Huangqin by liquid chro matography coupled with electrospray ionization mass spectr ometry [J].J Chromatogr B,2007,848:355-362.

[4]张建伟,赵倩,何希荣,等.UPLC测定银黄颗粒中绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素6种成分[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(18):50-53.

[5]王荣梅,徐丽华,林永强.HPLC法同时测定银黄含片中6个咖啡酰奎宁酸类成分的含量.药物分析杂志,2012,32(1):57-60.

[6]杨静.对银黄含片中四种活性成分含量同时测定方法的研究[J].当代医药论丛,2014,21(19):53-55.

[7]张婷,美尔哈巴·热西提,林潇,等.HPLC-MS/MS法测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷[J]. 中草药,2012,43(4):711-713.

[8]刘永利,李冬梅,冯丽,等.RP-HPLC同时测定银黄胶囊中绿原酸与黄芩苷含量[J].中成药,2006,28(8):1142.

Determination of eight components in Yinhuang buccal tablets by UPLC

YU Hai-bo1
（Xuzhou Institute for Food and Drug Control, Xuzhou 221006, China）

Objective To study determination of eight active constituents in Yinhuang buccal tablets by UPLC. Methods To determine contents of chlorogenic,caffeic acid, galuteolin , baicalin, luteolin ,wogonoside, baicalein ,wogonin in Yinhuang buccal with UPLC . Results The 8 active constituents in Yinhuang are on good terms, correlation coefficient are all less than 0.9997, average recovery are all between 97.3%～102.0%,RSD are all lower than 1.2% . Conclusion The effect of determinate active constituents with UPLC is good, and we can control quality of Yinhuang buccal tablets with UPLC,.

UPLC ；Yinhuang buccal tablet；active constituents ；Content determination

R284.1

B

2095-7629-（2017）19-0173-03

徐州市科技计划项目（XF11C039）

于海波，E-mail：yuhaibobo@sohu.com