pEGFP-N1-NUCB2真核表达质粒的构建及在SH-SY5Y细胞中的转染效率

田小菲 陈财良 高如阳 张建岭 史满金 张国徽

(河北北方学院法医教研室，河北 张家口 075000)

pEGFP-N1-NUCB2真核表达质粒的构建及在SH-SY5Y细胞中的转染效率

田小菲 陈财良 高如阳1张建岭1史满金 张国徽

(河北北方学院法医教研室，河北 张家口 075000)

目的构建pEGFP-N1-NUCB2重组子并比较Lipofectamine 2000和Xfect两种转染试剂在进行神经细胞转染时的转染效率。方法构建pEGFP-N1-NUCB2重组子，然后采用碱裂解法进行质粒DNA的提取，PEG-MgCl2进行质粒DNA的纯化，最后将纯化的质粒DNA分别用两种不同转染试剂分别在HEK293细胞和SH-SY5Y细胞中进行转染。结果采用Lipofectamine 2000进行pEGFP-N1-NUCB2重组子的转染实验，发现在HEK293细胞中可以转染成功，但是在SH-SY5Y细胞中基本没有荧光显现；采用Xfect进行pEGFP-N1-NUCB2重组子的转染实验，发现在SH-SY5Y细胞中虽有荧光显现，但是转染效率非常低。结论Xfect的转染效率高于Lipofectamine 2000，pEGFP-N1-NUCB2在SH-SY5Y细胞中采用脂质体进行转染很难成功。

Lipofectamine 2000;Xfect；SH-SY5Y；细胞转染

过表达研究是机体内低表达基因进行基因功能分析的强有力手段。SH-SY5Y细胞系是帕金森病(PD)等神经退行性疾病发病机制研究中一种常见的体外模型，因其有多巴胺能神经元的一些特性〔1〕，此细胞可分泌酪氨酸羟化酶(TH)、β-多巴胺羟化酶和多巴胺转运蛋白；而且，此细胞株经不同诱导作用后可以分化为带有不同基因型和不同生物化学特征的成熟型神经细胞。pEGFP-N1是常用的真核表达载体，其自身携带的GFP荧光标记便于转染结果的观测和后续的实验分析。本研究构建pEGFP-N1-NUCB2重组子，进一步分析NUCB2过表达之后对百草枯引起的SH-SY5Y细胞死亡是否有抑制作用。

1 材料与方法

1.1实验材料 神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)购于中科院细胞中心(源自美国ATCC)；胎牛血清(FBS)和DMEM/F12培养基，Hyclone公司；Trizol试剂，Millpore公司；KpnⅠ和BglⅡ限制性内切酶，连接酶，Takara；Lipofectamine 2000转染试剂，Invitrogen公司；Xfect转染试剂，Takara公司；TOP10感受态细胞，天根公司。

1.2细胞培养 SH-SY5Y细胞用含有10% 胎牛血清的DMEM/F12培养液(青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml)悬浮，以5×106个/ml密度接种于直径10 cm培养皿，置于细胞培养箱中，在37℃，5%CO2，湿化条件下培养，待细胞覆盖率达90%左右时，常规胰酶消化传代。

1.3pEGFP-N1-NUCB2重组子的构建 NUCB2克隆引物的设计：上游引物5'-GAAGATCTTTTATTTACCTGCCTGAACATGAGGTGGA-3'，下游引物5'-GGGGTACCCAAATGTGTGGCTCAAACTTCAATTCTCC-3'，收取SH-SY5Y细胞的总RNA，反转录成cDNA，进行NUCB2基因PCR扩增。将扩增产物和pEGFP-N1载体相同条件下采样KpnⅠ和BglⅡ进行酶切，纯化后进行连接反应。连接产物在TOP10感受态细胞中进行转化，最后进行质粒DNA的提取和纯化，测序验证连接产物的序列。

1.4转染 将细胞种于35 mm培养皿中，每孔5×105个细胞，此步骤中用的培养基为DMEM/F12含10%FBS，不含抗生素。24 h内做转染处理，细胞换液，换双无DMEM/F12培养基，每孔加入4 μg质粒DNA，8 μl转染试剂，培养箱中孵育4～6 h。转染试剂处理4～6 h之后，细胞换DMEM/F12含10%FBS，不含抗生素的培养基，继续培养箱中孵育48 h。荧光显微镜下观察转染结果，并采集图片。

2 结 果

pEGFP-N1-NUCB2重组子构建成功之后用酶切和测序两种方法进行鉴定，结果均提示连接成功。首先用Lipofectamine 2000在HEK293细胞中进行重组子和空载体的转染效率比较，结果发现pEGFP-N1空载体在HEK293细胞中采用Lipofectamine 2000转染效率很高，但是pEGFP-N1-NUCB2重组子的转染效率明显降低，再将pEGFP-N1-NUCB2重组子选用Lipofectamine 2000相同条件下在SH-SY5Y细胞中进行转染，结果显示在SH-SY5Y细胞中空载体的转染效率非常低，重组子的转染基本没有成功，见图1，此结果说明，用Lipofectamine 2000进行转染时，无论是HEK293细胞，还是SH-SY5Y细胞中的转染，重组子的转染效率均较空载体低。进一步采用Takara公司研发的Xfect转染试剂进行SH-SY5Y细胞的转染，结果显示，重组子的转染效率亦过低，但是明显高于Lipofectamine 2000的转染效率，见图2。

图1 采用Lipofectamine 2000在HEK293、SH-SY5Y细胞中转染(×400)

图2 Xfect在SH-SY5Y中转染(×400)

3 讨 论

NUCB2可参与肿瘤坏死因子(TNF)-肿瘤坏死因子受体(TNFR1)系统介导的细胞凋亡过程〔2〕，胞外TNFR1与NUCB2-Arts1(调节TNFR脱落的氨基肽酶)结合形成复合物，进而影响其与TNF-α的结合，从而影响TNFα-TNFR1系统介导的程序性细胞死亡过程的发生〔3〕。又有报道，细胞凋亡发生过程中的caspase能对NUCB2进行裂解〔4〕。本研究显示NUCB2的表达量降低〔5〕，可引起SH-SY5Y细胞的凋亡，这与上述NUCB2的作用机制吻合。因此本研究小组构建了pEGFP-N1-NUCB2重组子，以期观察NUCB2过表达之后的是否抑制了SH-SY5Y细胞的凋亡发生。本实验结果显示采用脂质体方法进行细胞转染在SH-SY5Y细胞中很难成功，虽然Xfect的转染效果要优于Lipofectamine 2000，但是这两种试剂的转染结果都很难进行后续的过表达研究分析。虽然有报道，在SH-SY5Y细胞中pEGFP-N1载体所构建的重组子进行转染实验可以达到后续实验要求的转染效率〔6〕，但是本研究数据提示，如果需要进行神经细胞的过表达研究，应该进行除脂质体转染外的其他转染方法的尝试。

1Chade AR,Kasten M,Tanner CM.Nongenetic causes of Parkinson's disease〔J〕.J Neural Transm Suppl,2006;(70):147-51.

2Roy DN,Mandal S,Sen G,etal.14-Deoxyandrographolide desensitizes hepatocytes to tumour necrosis factor-alpha-induced apoptosis through calcium-dependent tumour necrosis factor receptor superfamily member 1A release via the NO/cGMP pathway〔J〕.Br J Pharmacol,2010;160(7):1823-43.

3Aebischer J,Sturny R,Andrieu D,etal.Necdin protects embryonic motoneurons from programmed cell death〔J〕.PLoS One,2011;6(9):e23764.

4Islam A,Adamik B,Hawari FI,etal.Extracellular TNFR1 release requires the calcium-dependent formation of a nucleobindin 2-ARTS-1 complex〔J〕.J Biol Chem,2006;281(10):6860-73.

5田小菲，张 晓，张经一，等.百草枯诱导的SH-SY5Y细胞中核连蛋白2基因的表达变化〔J〕.中国老年学杂志，2017；37(13)：3158-60.

6Yu XL,Gao DW.Overexpression of cytoglobin gene inhibits hypoxic injury to SH-SY5Y neuroblastoma cells〔J〕.Neural Regen Res,2013;8(23):2198-203.

〔2016-11-10修回〕

(编辑 曹梦园)

R39

A

1005-9202(2017)22-5545-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.025

河北省卫计委基金项目(20170179)；河北北方学院创新人才培育基金项目(CXRC1323)

1 河北北方学院2012级法医学本科1班

张国徽(1962-),男,教授,硕士生导师,主要从事法医学研究。

田小菲(1983-),女,讲师,主要从事法医学研究。