锁阳与寄主白刺的ITS2条形码特征及遗传关系△

王梦亮，张艳艳，2，贾岩，2，崔晋龙*，王俊宏

(1.山西大学 应用化学研究所，山西 太原 030006；2.山西大学 生物技术研究所，山西 太原 030006)

·基础研究·

锁阳与寄主白刺的ITS2条形码特征及遗传关系△

王梦亮1，张艳艳1，2，贾岩1，2，崔晋龙1*，王俊宏1

(1.山西大学 应用化学研究所，山西 太原 030006；2.山西大学 生物技术研究所，山西 太原 030006)

目的采用ITS2条形码对寄生植物锁阳-白刺进行分子标记鉴定，并分析它们之间及它们近缘种的亲缘关系。方法通过改良的CTAB法提取基因组DNA，通用引物扩增rDNA-ITS2的内转录间隔区，经DNAstar软件校对拼接，预测植物的ITS2二级结构图；利用MEGA 6.06软件计算种内、属间Kimura-2-parameter遗传距离；通过中药材DNA条形码鉴定系统比对和邻接法构建系统聚类树，分析属间、种间和种内遗传关系。结果锁阳和白刺的ITS2序列长度分别为229 bp和232 bp，GC含量分别为48%和63%。锁阳和白刺的种内遗传距离分别为0～0.004 4和0～0.022；锁阳和白刺的属间遗传距离为2.234 0～2.443 3。结论ITS2条形码可以很好地鉴定、区分锁阳、白刺及它们的近缘种之间的系统发生关系。

寄生植物；ITS2；锁阳；白刺；亲缘关系；沙生药

生长于沙漠地带的植物锁阳CynomoriumsongaricumRupr.，常寄生在蒺藜科白刺属(NitrariaL.)植物的根部[1]，是我国少数来源于沙漠的寄生植物药之一，是历版《中华人民共和国药典》(《中国药典》)收录的常用中药[2]，也是中国蒙古族等少数民族使用悠久的民间药物[3]，《中国药典》记载其功能和主治为“补肾阳，益精血，润肠通便。用于肾阳不足，经血亏虚，腰膝萎软，阳痿滑精，肠燥便秘”。其寄主多为蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺属(NitrariaL.)的唐古特白刺N.tangutorumBobr.等植物，是我国重要的防风固沙植物，也具有药用价值，其果实常用来治疗脾胃虚弱、消化不良、神经衰弱等。由于果实具有抗氧化、降血脂的作用，因此还有延缓衰老、防治动脉硬化的功效[4-5]。

DNA条形码(DNA barcoding)技术是利用准确的、有足够变异的、扩增后相对较短的DNA片段，在种内具有特异性而在种间具有多样性特征的生物身份识别系统。它可以针对物种进行快速自动鉴定，是近几年生物分类鉴定的研究热点[6]。为了确定我国药用植物DNA条形码应用的有效性，2010年Chen等[7]对7个候选DNA条形码(psbA-trnH，matK，rbcL，rpoCl，ycf5，ITS2，ITS)进行研究，最后得出结论，来自核DNA的ITS2(internal transcribed spacer 2，ITS2)是中药材鉴定研究中最适合的DNA条形码，首次提出把ITS2作为药用植物鉴定标准的DNA条形码。其课题组的Yao等[8]研究并提出ITS2可作为植物物种鉴定的通用条形码。结合Koetschan等建立的ITS2数据库及网站预测ITS2二级结构[9]，人们可以直观地进行物种的鉴定和遗传关系的分析。本研究从我国锁阳主产地腾格里沙漠边缘地带的阿拉善左旗采集锁阳-白刺寄生体，着重采用ITS2对双方进行种属鉴定，并对它们近缘种遗传关系进行分析，为采集地基原药材及其寄主的质量、药材监管及临床用药安全等提供科学数据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Nano Drop 2000(Thermo Scientific，美国)。

1.2 材料

锁阳-白刺植物材料于2016年6月采集于阿拉善左旗锡林高勒，山西大学应用化学研究所崔晋龙博士对锁阳和白刺2个物种14个采集地的植物进行鉴定，标本存放于山西大学应用化学研究所。另外，本研究还选用GenBank数据库中的8个锁阳和白刺近缘种数据作为本实验的参考比较数据。实验材料信息见表1。

2 方法

2.1 DNA提取

取新鲜样品锁阳茎及白刺叶各20～25 mg，液氮研磨，研磨后的样品采用改良的CTAB法提取样品基因组DNA[10]，用Nano Drop 2000检测DNA浓度，放-20 ℃备用。

2.2 PCR扩增及测序

利用ITS2通用引物ITS 2F、5′ATGCGATACTTGGTGTGAAT 3′、ITS 3R、5′GACGCTTCTCCAGACACAAT 3′[11-12](由上海生工生物工程股份有限公司合成)进行目标区域PCR扩增。25 μL反应体系包括2×Easy Taq PCR SuperMix(TransGen Biotech Co，China)12.5 μL，2.5 mmol·L-1引物各1 μL，模板DNA 1.5 μL，dd H2O 9 μL。

扩增程序：94 ℃，变性5 min；94 ℃变性30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s(40个循环)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测纯度后，送上海生工生物工程公司双向测序。

2.3 数据处理

测序后，用DNAStar对序列校对拼接，去除引物区，获得准确一致性序列。对所获得的序列采用基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除两端5.8 S和28 S区获得ITS2区[13]，同时获得ITS2序列的二级结构预测图。使用MEGA 6.06对ITS2间隔区进行多序列比对，计算K2P种内、种间和属间遗传距离，采用邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育树。利用BLAST法和距离鉴定法对锁阳、白刺及它们的同属近缘种进行亲缘关系分析。

3 结果与分析

3.1 ITS2对样品的鉴定

实验成功提取样品基因组DNA，PCR产物测序结果提交至GenBank网站，序列号见表1，与GenBank库数据比对，确定样品的种属地位，所有样品与基因库对应植物序列的相似性都介于97%～100%，确定为锁阳CynomoriumsongaricumRupr.和白刺NitrariatangutorumBobr.。具体结果见表1。

3.2 对Genbank数据库下载序列的正确性考察

从Genbank数据库下载的8个锁阳和白刺同种或近缘种ITS2序列，通过MEGA 6.06软件与ITS2网站(http：//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)分析，发现其序列长度与样品的序列长度一致，均为229 bp、232 bp，GC含量相同，均为48%、63%，见表1。此外，均具有二级结构预测图，且与锁阳、白刺的二级结构预测图一致，见图2、3。

3.3 锁阳和白刺的ITS2序列与K2P遗传距离分析

在本研究中，8个锁阳样品的ITS2序列长度均为229 bp，GC含量均约为48%，序列变异较小，仅有2个变异位点和1个信息位点，分别是第193位和217位；6个白刺样品，序列长度均为232 bp，GC含量均约为63%，有6个变异位点和2个信息位点，序列变异较小。基于K2P模型的遗传距离结果表明，锁阳的种内遗传距离为0～0.004 4，白刺的种内遗传距离为0～0.022，锁阳和白刺的种内变异均小。锁阳和白刺之间的属间变异较大，属间遗传距离为2.234 0～2.443 3。白刺的种间遗传距离为0.032 4～0.188。数据表明，样品的属间遗传距离明显大于锁阳、白刺的最大种内遗传距离，白刺的种间遗传距离大于种内遗传距离。因此，ITS2序列可以区分开药材锁阳和白刺以及它们的亲缘种属样品，本研究中样品的ITS2标记特征信息见表1。

3.4 亲缘关系分析

基于ITS2序列构建各样品的NJ系统树(见图1)表明，所有采集的锁阳样品与GenBank库中的同种植物聚为同一个分支，种内遗传距离相近，变异最小，表现出明显的单系性。白刺样品与GenBank库中报道于中国甘肃的唐古特白刺DQ267176.1聚在一起，采集于内蒙古的白刺样品种内遗传距离最近，其次是报道于甘肃的同种白刺DQ267176.1，同属不同种2个凹叶白刺KP087772.1、KP087773.1聚为一枝，其白刺种间遗传距离明显大于种内遗传距离。从结果可以看出，ITS2作为条形码，不仅可以明显区分不同属物种，而且可以有效分析种属之间的进化关系。

3.5 锁阳和白刺ITS2序列的二级结构

本研究通过ITS2网站对锁阳和白刺的ITS2序列进行二级结构预测。从选取部分锁阳种内ITS2结构可以看出(见图2)，所有锁阳的4个螺旋区在茎环数目、大小、角度、位置以及茎环发出的角度等方面基本相同。而白刺种间ITS2预测的二级结构比较中(只选取部分，见图3)，KX813697在螺旋区Ⅲ有5个茎环，2个大3个小；在螺旋区Ⅳ有3个茎环，1个大2个小；而KP087772.1在螺旋区Ⅲ中有6个茎环，4个大2个小；在螺旋区Ⅳ有3个茎环，3个都大，最后两个茎环距离很近。由此可以看出，锁阳和白刺以及白刺同属各种ITS2序列的二级结构有明显差异。

表1 实验材料来源、ITS2序列及GenBank登录信息

注：Pasturea：指阿拉善左旗锡林高勒苏木三校大队西北牧场。

注：bootstrap 1000次重复，枝上数值仅显示自展支持率≥50%。图1 采用邻接法对锁阳和白刺ITS2序列构建的系统聚类树

图2 锁阳种内ITS2二级结构预测图

图3 白刺种间ITS2二级结构预测图

4 结论与讨论

锁阳是为数不多的、来源于沙漠地带的寄生植物药之一，主要寄主为唐古特白刺[1]。本研究以DNA条形码为技术手段，对两个物种之间以及它们各自的种内和种间亲缘关系进行研究，既从技术上克服了形态鉴定法比较粗放的缺陷，也能够避免对锁阳和白刺的单独研究而忽视寄生关系带来的弊端。这对于两者的研究和开发中的物种跟踪及鉴定、寄生发生机理、基因交流、物质交换等的研究都具有重要意义。

分子生物学鉴定方法(如RFLP技术、RAPD技术和SSR技术)虽在中药植物鉴定研究中表现出独特优势[14-15]，但是由于存在通用性低、可重复性不强等特点，使得该方法在药用植物的鉴定过程中出现了很多弊端。DNA条形码技术的出现，为快速、便捷、标准化鉴定药用植物，创造了良好的条件[11]，因此，以ITS2条形码作为中药材标记技术已经在许多药用植物中进行了应用[7-8，12]，人们强烈呼吁将ITS2序列列为植物类药材核心条形码序列[16]。此外，ITS2二级结构的研究也具有一定的系统和分类价值[7，17-18]。因此，采用ITS2研究主产地锁阳及其寄主的亲缘关系，阐明其ITS2特征，为补充我国中药材ITS2条形码研究库提供了科学依据。

随着样品量的增大，要将大量复杂类群的寄生植物准确鉴定到种，如解决本研究中的锁阳与寄主白刺样本鉴定问题，验证其易混品及种间差异，利用ITS2序列在物种鉴定上的准确性和快速性，我们选择了GenBank库中5个锁阳商品、报道于甘肃的N.tangutorum(No.DQ267179.1)、报道于新疆的2个近缘种凹叶白刺N.retusa(KP087772.1、KP087773.1)，以ITS2分子标记特征能够灵敏地分析它们的序列特征以及近缘种之间的关系，这对于研究锁阳-白刺寄生双方ITS2遗传特征及遗传关系，具有高效、快速、准确等优势。

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MolecularMarkerandGeneticRelationshipAnalysisofCynomoricumsongaricumandItsHostNitrariatangutorumbyITS2BarcodeSequence

WANGMengliang1，ZHANGYanyan1，2，JIAYan1，2，CUIJinlong1*，WANGJunhong1

(1.Instituteofappliedchemistry，Shanxiuniversity，Taiyuan030006，China；2.Instituteofbiotechnology，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China)

Objective：Identification and genetic relationship ofCynomoriumSongaricumand its hostNitrariatangutorumwere investigated by ITS2 molecular marker analysis.MethodsThe genome DNA of plant was extracted by modified CTAB method.Internal transcribed spacer of rDNA-ITS2 was amplified by universal premiers of ITS2，then was aligned and jointed by DNAstar.The secondary structure of ITS2 was predicted in professional web.Intraspecific and intergenic genetic distances ofC.songaricumandN.tangutorumwere detected with Kimura-2-parameter by MEGA 6.06 software.DNA barcode analysis system and neighbor-joining method were used to create polygenetic tree to analyze genetic relationships.ResultsITS2 sequences ofC.songaricumandN.tangutorumwere 229 bp and 232 bp，respectively.GC contents were 48% and 63%，respectively.Intraspecific genetic distances ofC.songaricumandN.tangutorumwere 0-0.004 4 and 0-0.022，respectively.Interspecific genetic distance ofC.songaricumandN.tangutorumwas 2.234 0-2.443 3.ConclusionITS2 barcode was an effective method for specific identification and evaluation of genetic relationship toC.songaricumandN.tangutorum.

Parasitic plant；ITS2；CynomoriumsongaricumRupr.；NitrariatangutorumBobr.；genetic relationship

国家自然科学基金(31670328，31270383)；林业公益性行业科研项目(201304326)

*

崔晋龙，博士，副教授，研究方向：珍稀药用植物及内生真菌资源开发；Tel：(0351)7016101，E-mail：CJL717@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.007

2017-04-06)