青霉素G酰化酶反应机理的说明

刘芳

摘 要：对变异的大肠杆菌ATCC 11105中提取的青霉素G酰化酶的反应及其逆反应动力学的研究和其反应常数的确定，结果表明，酶会被过量的青霉素G和两种产物所抑制。在正反应方向的脱酰作用中观察到6-氨基青霉烷酸（6-APA）的非竞争性抑制和苯乙醛酸的竞争性抑制。逆酰化反应的最适pH是5.7。此逆反应的机制被研究，底物抑制的影响也被研究，如6-APA，苯乙酸和产物。结果表明，青霉素G是逆反应的混合型抑制剂。版权为2001 Elsevier科学股份有限公司所有。

关键词：青霉素G酰化酶；单一可逆反应；可逆单一反应；抑制；动力学；反应机理

中图分类号：TB 文献标识码：A doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2017.34.096

1 简介

青霉素G酰化酶（PG酰化酶，EC3.5.1.11）催化青霉素分子中线性氨键水解成β-内酰胺分子，6-氨基青霉烷酸（6-APA）和相应的羧酸。PG酰化酶用于工业半合成青霉素和头孢菌素的6-APA和7-氨基-3-脱酰头孢菌酸（7-ADCA）的生产过程中。半合成青霉素是在酸性或中性环境中（pH4.0-7.0）产生，而6-APA和7-ADCA则是在碱性中（pH7.5-8.5）产生。PG酰化酶可以利用酵母，细菌或霉菌生产。多数的PG酰化酶是用大肠杆菌生产的。重组大肠杆菌（如ATCC 31052，11105，21285和14945）消除了一些PG酰化酶生产中遇到的问题如糖和其他碳源的代谢抑制。在多数的工业生产过程中，部分纯化酶用在细胞或酶在不同支持物上的固定化。由于产品成本低，细胞的固定催化会更有利益。

在间歇和连续培养的搅拌反应器中用固定化青霉素酰化酶和它的不能溶解衍生物，描述为大肠杆菌中PG酰化酶的分离和动力学青霉素酰化酶转化为6-APA。最近的研究包括从大肠杆菌ATCC 11105的变种中提取出的并固定在过氧聚丁二烯-丙烯酸凝胶上青霉素G酰化酶的反应动力学机理，青霉素G酰化酶生物催化剂的特点和应用以及工业上以硅土为载体的青霉素G酰化酶的准备的固定化研究。

在水相中，青霉素G酰化酶断开青霉素G分子的肽链，产生一种羧酸和6-APA。目前，青霉素G酰化酶无论是自由的还是固定化的都只有其正反应动力学被研究过，至今还没有关于其逆反应动力学的报道，例如6-APA和羧酸在青霉素G酰化酶的作用下产生青霉素G和水的生物催化反应。正逆反应的研究和因此整个反应动力学的参数与完成比率的相等的结论需要用来预测应用在这种酶反应的反应器的性能。在目前的文章中，研究了正逆反应的稳态动力学。底物和产物对反应机理和抑制的影响以及整个反应的动力学参数都已经确定了。

2 材料和方法

2.1 材料和微生物

6-APA从Nakalai Tesque（东京，日本）购买，青霉素G钠盐由Jaber Ibn-e-Hayan Pharmaceutical公司（德黑兰，伊朗）提供。所有试剂都是微生物纯或分析纯的。分析纯的和酶分离与纯化的化学纯的试剂是从Merck AG（达姆施塔特，德国）和Sigma（圣路易斯，澳门）。

大肠杆菌ATCC 11105的变种是由沙里夫技术大学（德黑兰，伊朗）的生化和生物环境工程研究中心提供的。间歇培养在0.500 L的摇瓶中装入0.100 L。震动设为250 rpm温度25℃培养48h。培养基组成如下（重量/体积）%：苯乙酸0.20%，酵母膏0.50%，NH4Cl 0.10%，K2HPO4 0.10%， KH2PO4 0.01% 和MgSO4·7H2O0.02%。

2.2 酶分离和纯化

大部分细胞都是菌悬液在转速6000rpm温度为0-4℃条件下通过40分钟管状离心从培养基中分离出来的。细胞破壁是菌悬液在pH7.8的0.10M的磷酸缓冲液中利用90周波的超声仪作用90秒。菌悬液经过在转速8000rpm温度为0-4℃条件下通过管状离心去除细胞碎片。利用（NH4）2SO4溶液沉淀法使酶液部分纯化。酶液在（NH4）2SO4的饱和度为40-60%时沉淀分离在0.10M、pH7.8的磷酸缓冲液中。溶液渗析后，收集沉淀，利用EDTA-纤维素作进一步纯化。

2.3 蛋白含量和酶活的测定

利用Lowry法测蛋白含量。用Balasingham法测定PG酰化酶的比活力，如下。PG酰化酶活力一单位即1U，指在pH7.8、温度37℃100mM的磷酸缓冲液中1分钟分解1μmol的青霉素G转化为6-APA所需的酶量。

3 结果与讨论

3.1 整个反应动力学与平衡常数

从不同种类的大肠杆菌获得的PG酰化酶的催化下的青霉素的水解会被底物的高浓度抑制，此反应的产物6-APA和苯乙酸（PAA）分别产生非竞争性抑制和竞争性抑制。在PG酰化酶（E）催化下的青霉素的脱酰化正反应的稳态动力学包括一种底物和两种产物即6-APA和PAA（Q）。

3.2 正反应的动力学

3.3 正反应中底物（青霉素G）抑制的影响

高浓度的青霉素G（30.00， 40.00， 50.00，60.00 和70.00 mM）对底物抑制的影响很明显，据研究它也受底物抑制常数Kia的影响。青霉素G浓度在这样的范围（30.00-70.00mM），6-APA的产率会随着青霉素G的浓度的增加而降低。这表明了青霉素G在上述浓度范围内的抑制影响。

3.4 正反应产物（PAA和6-APA）的抑制影响

实验结果表明青霉素G酰化酶会产生底物抑制。为了研究产物的抑制影響，分别测定PAA或6-APA的不同量时的反应速率。

缺乏6-APA时，不同浓度的PAA （0.50，0.75，1.00，1.25mM）和青霉素G （1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）的截距值，表明了PAA的竞争性抑制。endprint

缺乏PAA时，研究不同浓度的6-APA （0.20，0.30，0.40，0.50 和0.60mM）和青霉素G （1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）的抑制影响，在抑制物的缺乏与存在时，6-APA的非竞争性抑制受到影响。结果显示青霉素G的加入可产生两种产物抑制：首先非竞争性抑制（6-APA）然后是竞争性抑制（PAA）。因此，PG酰化酶催化的青霉素G反应是一种有序的单一双向反应。

3.5 逆反应的pH最优化

正反应是在碱性条件（pH=7.8）下的，在青霉素G酰化酶催化下的6-APA与PAA（酰化）反应在酸性条件下。这个反应在一定pH之下才能进行，pH是由酶反应与6-APA，PAA，青霉素G和酶原之间折中决定的。青霉素G（正反应）酶水解的最适pH为7.8，产物的形成和青霉素G和6-APA的退化都可以忽略。在最适pH下，水解时的缓冲要求会降低，低的产物抑制影响会很明显。众所周知这种酰化反应只能在pH5.0到6.0中进行。磷酸盐，柠檬酸盐和磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液用于pH为4.5，5.0，5.3，5.7和6.0，为了优化酰化反应的pH值和选择合适的缓冲液类型。产物浓度，青霉素G浓度在反应120s中测定1.00mM6-APA和PAA。产生最大量的青霉素G的条件为pH=5.7，100mM柠檬酸盐缓冲液浓度可得到0.05mM的青霉素G。青霉素G的最高浓度为0.03和0.02mM，条件为pH=5.7由100mM磷酸盐和磷酸-柠檬酸盐缓冲液提供。因此，逆反应的最优条件为用100mM柠檬酸缓冲液构建pH=5.7，产物（青霉素G）和反应物（6-APA和PAA）对于后续的反应处理要足够，而且酶反应的速率（青霉素G產量最大）也最大。

3.6 逆反应的动力学

研究逆反应的动力学要在两种不同条件下：在不断改变的PAA浓度时测定6-APA的浓度。当6-APA浓度改变，逆反应的速率方程如等式（4）所示有Segel给出。

不同浓度的PAA（1.00，2.00，3.00，4.00和5.00mM）的逆反应动力学结果即当副底物6-APA在不同的固定浓度（2.00，3.00，4.00 和5.00 mM）时1/v和1/Q成比例。在6-APA或PAA作为变化的底物的两种不同情况下，其逆反应的动力学常数的结果都很一致。因此，此可逆反应的假设机理也很好的符合了这个以PG酰化酶催化产生6-APA和PAA的可逆双向单一反应的实验动力学资料。

3.7 在可逆反应中产物（青霉素G）的抑制影响

低浓度的青霉素G（0.02，0.04，0.06和0.08 mM）用于研究此可逆反应中青霉素G的抑制反应。较高浓度的青霉素G可能会导致正反应过强。在两种独特的条件下研究这种抑制反映：固定PAA的浓度（2.00mM）改变6-APA的浓度（1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）和固定6-APA的浓度（2.00mM）改变PAA的浓度（1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）。测定产生的6-APA（青霉素G的产物）的浓度，利用柠檬酸缓冲液将pH调制5.7。此变化6-APA浓度的双向单一可逆反应的产物抑制速率平衡方程如等式（6）所示由Segel给出。

反应中产物抑制的动力学常数是由A的不同浓度下和一定的P不饱和浓度下，1/v与1/Q的比值得出的。由P和Q的不饱和浓度得出的Kia和Kma的值。表示青霉素G作为一种混合型抑制剂在PAA不饱和时与6-APA有关。饱和的PAA会掩盖这种抑制。另一方面，青霉素G是一种在任意6-APA浓度下都与PAA有关的竞争性抑制剂。饱和6-APA使当前的Vmax变为真实的Vmax，但当前的Kmq依然取决于A。速率比率的常数是： k1/k-1=0.05； k2/k-2=-1.28； k3/k-3=1.69。从1/A的斜率或1/v轴的截距与抑制物浓度的比值计算得出的表观值kis值，此值可以由反应的动力学常数的定义或酶抑制物混合物的不相关常数来确认。正反应和逆反应的机理和它们的比率等式以及动力学常数可用来分析反应的动力学和预测青霉素G向6-APA转化的酶生化反应的表现。

参考文献

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