磁性前列地尔脂微球靶向治疗大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤的基础研究

王彦进+肖义青+陈振雨

[摘要]目的：探讨磁性前列地尔脂微球靶向治疗大鼠腹部皮瓣缺血-再灌注损伤的作用机制及疗效。方法：制备大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤的动物模型，实验组注射磁性前列地尔脂微球，并在皮瓣外覆盖铷铁硼稀土磁铁；对照组注射生理盐水；空白组不进行血管阻断及药物注射。测定三组皮瓣血流量、皮瓣组织丙二醛和一氧化氮含量；皮瓣原位缝合后7d评估皮瓣成活率，并检测皮瓣组织中血管内皮生长因子的表达情况。结果：与对照组及空白组比较，在皮瓣缺血-再灌注过程中实验组皮瓣微循环血量明显增多、皮瓣组织内一氧化氮水平升高、丙二醛水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）；皮瓣原位縫合7d后皮瓣成活率显著提高（P<0.05）。结论：本实验制备的具有磁场顺应性的前列地尔脂微球可有效提升缺血-再灌注皮瓣部位的药物浓度、改善皮瓣微循环、降低缺血-再灌注损伤，进而提高皮瓣成活率。

[关键词]前列地尔脂微球；磁性；靶向治疗；缺血再灌注损伤

[中图分类号]R331.3 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）10-0060-04

Abstract： Objective To investigate the effect of magnetic alprostadil lipid microsphere in targeting treatment of ischemia-reperfusion injury of abdominal flaps in rats. Methods To prepare animal models of ischemia-reperfusion in rat ventral flap. The experimental group was injected magnetic alprostadil lipid microsphere and covered the flap up with rubidium iron boron magnet.The control group was injected with saline. The blank group was only prepared the abdominal flap， without vascular occlusion or drug injection. At the same time point of the experiment， blood flow， MDA and NO concentrations of each group was detected separately， the skin flap survival rate was evaluated 7 days after skin flap suture， and detected VEGF expression simultaneously. Results During the flap ischemia reperfusion process，the microcirculation volume in experimental group was significantly increased， and the flap NO levels increased， while MDA level decreased， the difference was statistically significant（P<0.05）. Survival rate of the flap increased significantly after suture 7d in situ（P<0.05）. Conclusion Targeting treatment using magnetic alprostadil lipid microsphere can effectively improve ischemia-reperfusion flap of drug concentration， improve skin microcirculation， reducing ischemia-reperfusion injury， and enhance the survival rate of flap.

Key words： alprostadil lipid microsphere； magnetic； targeting treatment； ischemia-reperfusion injury

皮瓣技术是外科治疗中一项重要的技术手段，广泛应用于整形外科、显微外科等专业领域。但是，在皮瓣移植过程中往往存在较长时间的皮瓣缺血缺氧期，再灌注时会对皮瓣组织造成一定程度的损伤，影响其成活。前列地尔是一种高效生物活性物质，可明显扩张血管，改善微循环。本研究是将前列地尔封入直径0.2μm的脂微球中，利用脂微球的载体特性[1]，在外磁场作用下，将药物运输到大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤部位，观察皮瓣不同时期的血流量、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）含量的变化情况，为临床应用磁性前列地尔脂微球改善皮瓣缺血再灌注损伤、促进皮瓣成活提供理论基础和实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物：健康纯种成年雌性SD大鼠，购自青岛大学医学院动物实验室，SPF级，180～300g，随机分成实验组、对照组和空白组三组，每组10只。

1.2 试剂：前列地尔（台湾，永光）；自制前列地尔脂微球，牛血清白蛋白（上海，天呈）；磁流体-铷铁硼磁铁（北京，莱博）；蓖麻油（广州，丹旺）；乙醚（深圳，多源）；无水乙醇（上海，浩然）；多聚甲醛（美国，Sigma）；MDA含量测定试剂盒（北京，索莱宝）；NO含量测定试剂盒（上海，碧云天）；VEGF抗体（美国，Santa Cruz）；即用型SABC免疫组化试剂盒（武汉，博士德）。endprint

1.3 仪器：激光多普勒血流仪（日本，Omega）；4℃冰箱（青岛，澳柯玛）；-80℃冰箱（青岛，海尔）；普通光学显微镜（德国，Leica）；荧光倒置显微镜（德国，Leica）；恒温水浴锅（深圳，深信）；高速离心机（美国，Beckman）。

1.4 方法

1.4.1 前列地尔脂微球制备：采用乳化热固化技术。取牛血清白蛋白250mg溶于10g/L前列地尔蒸馏水溶液中，添加磁流体0.2ml，与100ml含10%的蓖麻油混合，搅拌10min，超声乳化；另取蓖麻油100ml加热至160℃，在搅拌下加入上述乳浊液，160℃保温10min，搅拌6h；加入乙醚200ml脱脂，离心，弃去油相，沉淀依次用乙醚、乙醇漂洗，最后置换在蒸馏水中，冷冻干燥48h，即成微球粉末[2]。

1.4.2 大鼠腹部島状皮瓣模型制备：实验动物术前1d禁食，10% Na2S将腹部脱毛备用，3%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔内注射进行全身麻醉，参照Manson等[3]的方法设计以腹壁浅血管为蒂的3cm×6cm大小的岛状皮瓣，常规消毒后于皮下内膜层掀起皮瓣备用。

1.4.3 实验方法：皮瓣制备完成，用微血管夹夹闭腹壁浅动脉以阻断血流，使皮瓣缺血；5h后取下微血管夹，使皮瓣再灌注，同时经对侧股动脉插管，实验组注射磁性前列地尔脂微球，并在皮瓣外覆盖铷铁硼稀土磁铁；对照组注射生理盐水；空白组仅制备腹部岛状皮瓣，不进行血管阻断及药物注射。前列地尔脂微球及生理盐水注射首次剂量为20mg/kg，并以10mg/kg/min维持2h。实验组及对照组皮瓣再灌注后2h、空白组皮瓣制备后7h，原位缝合皮瓣。

1.5 观察指标

1.5.1 前列地尔脂微球磁响应观察：将前列地尔脂微球按浓度比1：10加入0.1%生理盐水中，超声分散，倒置显微镜下观察微球分散情况；同时，取混悬液1滴滴于载玻片上，然后将1块表面强度为3000高斯的铷铁硼磁铁置于载玻片一端，镜下观察微球运动及聚集情况[4]。

1.5.2 皮瓣血流量测定：于缺血前，缺血1h、2h和5h及再灌注5min、0.5h和2h时，以激光多普勒血流仪测定各组皮瓣血流量，单位nl/s。

1.5.3 皮瓣组织MDA和NO含量测定：三组均于皮瓣术后即刻、再灌注后0.5h及2h分别取皮瓣边缘全层组织100mg，按照晏泽等[5]的方法制成匀浆后测定MDA和NO含量。

1.5.4 皮瓣成活率测定：皮瓣原位缝合后7d用坐标贴纸法[6]测定皮瓣设计面积及成活面积，推算其成活率。皮瓣成活率=成活面积/设计面积×100%。

1.5.5 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）检测：皮瓣原位缝合7d后取皮瓣全层组织，多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋，取5μm连续切片，免疫组化法检测皮瓣组织VEGF表达[7]。

1.6 统计学分析：所有数据采用SPSS17.0软件包进行统计分析。计量资料用均数±标准差（x?±s）表示，采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 前列地尔脂微球磁响应情况：显微镜下可见前列地尔脂微球向铷铁硼磁铁一方快速移动聚集，约5min后脂微球几乎全部集中在磁铁一侧；随着滴液和磁铁之间距离的增大，脂微球移动速度明显下降。

2.2 皮瓣血流量测定结果：如表1所示，皮瓣缺血期微循环血流量随时间延长逐渐减少，缺血5h时皮瓣微循环血流量为缺血前微循环血流量的30%左右；再灌注后，实验组及对照组皮瓣微循环血量随时间延长逐渐增加，且实验组皮瓣血流量较对照组显著增多，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.3 NO含量测定结果：如表2所示，皮瓣术后即刻三组NO含量差异无统计学意义（P>0.05）；在皮瓣术后5.5h、7h，即再灌注后0.5h、2h，其NO含量空白组>实验组>对照组，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4 MDA含量测定结果：如表3所示，皮瓣术后即刻三组MDA含量差异无统计学意义（P>0.05）；皮瓣术后5.5h，即再灌注后0.5h，与空白组相比，实验组皮瓣组织中MDA含量无显著增加（P>0.05），对照组增加明显（P<0.05）；再灌注2h时，与空白组相比，实验组和对照组皮瓣组织内MDA含量均有增加，且对照组显著高于实验组（P<0.05）。

2.5 皮瓣成活率检测结果：原位缝合7d后，空白组皮瓣成活率为100%，实验组为（81.6±7.4）%明显高于对照组的（42.1±5.6）%，差异有统计学意义，P<0.05。见图1。

2.6 VEGF检测结果：原位缝合7d后，镜下可见，空白组皮瓣组织有大量毛细血管新生，血管内皮细胞中有大量VEGF表达，表现为分布密集的深棕色颗粒（图2A）；对照组新生血管数目最少，仅可见稀疏分布的浅棕色VEGF颗粒（图2B）；实验组新生血管数目较空白组少但明显多于对照组，可见较多VEGF表达，表现为相对密集的深棕色颗粒（图2C）。

3 讨论

皮瓣移植是整形外科常用的修复组织缺损和器官再造的重要手段，而缺血再灌注损伤是皮瓣坏死的重要原因，其发生机制目前尚不完全清楚。研究表明[8]，缺血再灌注损伤与氧自由基增多诱发的级联反应有关。MDA是脂质过氧化物下细胞膜损伤分解生成的产物，其含量可反应组织缺血缺氧的严重程度，通常MDA含量越高，组织缺氧情况越严重。NO是存在于各组织内具有明显血管舒张作用的自由基，已有研究表明，血管内皮细胞释放的NO对局部微循环具有抗缺血再灌注损伤的作用[9]。

前列地尔是天然前列腺素的一种，具有高效生物学活性，可明显扩张血管、抑制血小板聚集、保护血管内皮细胞改善微循环等。已有研究表明[10-11]，外加磁场可提高磁性药物在病变部位的靶向分布。脂微球对病变部位血管有较高的亲和性。应用磁性前列地尔脂微球减少皮瓣移植缺血再灌注损伤，提高皮瓣成活率的作用机制可能有：①磁性前列地尔脂微球减轻自由基对组织的损伤。本研究表明磁性前列地尔脂微球减少皮瓣移植缺血再灌注损伤过程中自由基的生成，抑制自由基形成的膜脂质过氧化反应，从而减轻组织结构损伤和功能障碍，这可能是磁性前列地尔脂微球减少缺血再灌注损伤、提高皮瓣移植成活率的重要机制之一；②磁性前列地尔脂微球增加NO的产生。其可能机制是磁性前列地尔脂微球通过增加一氧化氮合酶的水平和活性，刺激白介素、肿瘤坏死因子、细胞生长因子等细胞因子的产生促进NO的生成，从而起到改善微循环，减少缺血再灌注损伤，增加皮瓣成活率的作用；③磁性前列地尔脂微球增加VEGF表达和新生血管生成。主要机制是通过增加血管数目及血管内皮通透性，抑制炎症因子的释放，增强皮瓣内中性粒细胞的吞噬功能，增加皮瓣缺血区域新生血管的生成，从而改善缺血组织的微循环，提高皮瓣成活率；④磁性前列地尔脂微球减少白细胞浸润。其机制可能是磁性前列地尔脂微球可通过腺苷酸环化酶-蛋白激酶信号通路，抑制血小板活性因子、补体、肿瘤坏死因子等炎症介质的释放，减少VEGF、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、巨噬细胞集落刺激因子等多种生长因子的增加，减少中性粒细胞等向组织迁移和浸润，并能抑制白细胞对内皮细胞的粘附作用，减少白细胞的激活，抑制白细胞释放炎症介质，防止组织进一步损伤；⑤磁性前列地尔脂微球改善微循环。本研究结果表明，磁性前列地尔脂微球可有效改善皮瓣组织循环血流量，其机制是通过腺苷酸环化酶-磷酸二酯酶信号通路，作用于小动脉的平滑肌细胞和毛细血管前括约肌，致微循环开放；可抑制血小板聚集；改善微循环血液流变学性状；减少NF-κB、肿瘤坏死因子等炎症因子等细胞因子的释放，改善微血管通透性增加，减轻组织水肿和血管痉挛；稳定凝血功能，减少血栓生成；减少内皮素等血管活性物质的生成，抑制血管收缩，增加毛细血管血流灌注。endprint

本次研究中将前列地尔包裹在直径为0.2μg的脂微球内，实验证实前列地尔脂微球体的外磁响应性好，具有超顺磁性。其作用于病变部位具有如下优势：①高靶向性：脂微球进入血管后，主要与血小板一起在血管边缘流动，并可黏附于血管内皮细胞[12]，因此前列地尔脂微球可在外加磁场作用下聚集于病变部位，将药物运输至病变组织或器官，选择性的扩张该部位血管，促进侧枝循环的建立，改善局部微循环[13]；②药效持续时间长：前列地尔脂微球载体制剂在脂微球的屏障保护作用下，肺部对其灭活作用明显减少[14]，内皮网状系统对其的吞噬作用也明显减弱[15]；③降低不良反应发生率：在脂微球的保护下，前列地尔脂微球对血管的刺激及炎症反应均显著降低[16]。

本研究发现，注射前列地尔脂微球后，皮瓣微循环血量在短期内增加，远期成活率也显著提高。而对皮瓣组织的取样检测发现，皮瓣组织内NO水平增高，MDA水平降低，说明前列地尔脂微球对皮瓣微循环和皮瓣成活率的影响是通过增加NO含量、降低MDA的水平来实现的。这些结果进一步证实了Cordeiro等[17]的实验结果，同时对前列地尔的作用机制进行了更深层次地探讨。结果显示，具有磁场顺应性前列地尔脂微球，可更好地提高病变部位的药物浓度，减少药物在非病变部位的蓄积，改善皮瓣微循环，减轻缺血再灌注损伤，有效提高皮瓣成活率。

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[收稿日期]2017-06-26 [修回日期]2017-08-01

編辑/朱婉蓉endprint