文冠果壳抗氧化活性及抑制人HepG2细胞增殖活性部位筛选△

张严磊，肖鸿飞，施欢贤，宋忠兴，唐志书

(陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083)

文冠果壳抗氧化活性及抑制人HepG2细胞增殖活性部位筛选△

张严磊*，肖鸿飞，施欢贤，宋忠兴，唐志书

(陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083)

目的筛选文冠果壳的抗氧化及抑制肝癌HepG2细胞增殖活性部位。方法用水，10%、30%、50%、70%、95%乙醇水溶液从文冠果中提取得到A、B、C、D、E和F提取物，用清除自由基DPPH·能力筛选抗氧化活性部位，用MTT法筛选抑制肝癌细胞增殖的活性部位。结果6个提取部位均有抗氧化活性和抑制HepG2细胞增殖作用，其中E(70%乙醇水提取)部位的抗氧化活性最强，当质量浓度为0.2 mg·mL-1时，其对DPPH·清除率能达到70.82%；提取部位F(95%乙醇水提取)抑制HepG2细胞增殖作用最强，当其质量浓度为75 μg·mL-1时，抑制率高达70.1%。结论文冠果壳提取物具有抗氧化及抑制人HepG2增殖活性，具有开发前景。

文冠果壳；抗氧化；抑制肝癌细胞；筛选

文冠果XanthocerassorbifoliaBunge 为无患子科(Sapindaceae)文冠果属植物，单属单种，是我国特有的珍稀木本油料植物，有“北方油茶”之称，作为我国林业和科技部重力发展和扶持的农林作物，文冠果除作为油料树种外，该植物还有良好的药用、食用、观赏等价值[1]。目前，许多研究已从文冠果壳中分离出三萜、黄酮、生物碱、单萜及脂肪酸等类化合物[2-3]。对于其生物活性据目前研究，文冠果壳具有抗炎、治疗小儿遗尿、增强记忆、抗肿瘤等药理作用[4-5]，但是对于其抗氧化活性及细胞活性的研究较少。本文基于实现资源的节约、循环、变废为宝的原则，就其抗氧化及抑制人体HepG2细胞增殖的生物活性进行探索，从而为文冠果资源的综合开发利用提供理论基础与科学依据。

1 材料与试剂

1.1 材料

新鲜文冠果壳(杨凌普天农业科技有限公司)，通风处阴干、粉碎过4号筛，备用。

1.2 仪器与试剂

DMEM培养基(美国HyClone公司)；胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司)；双抗(北京索莱宝科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶(美国HyClone公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)；抗坏血酸(Vc)(成都科龙化工试剂公司)；1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)标准品(Sigma公司)；1，10-邻二氮菲(一水)(成都科龙化工试剂)；95%乙醇、无水乙醇、去离子水等试剂及溶剂均为分析纯。

1.3 细胞株

人肝癌HepG2细胞株(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。

2 方法

2.1 样品制备

称取适量文冠果壳细粉，按1∶4料液比分别与水，10%、30%、50%、70%、95%乙醇水溶液混匀水浴回流提取3次，每次2 h。过滤，去渣，将滤液浓缩得A、B、C、D、E和F 6个部位的浸膏。

2.2 抗氧化活性部位的筛选

2.2.1 样品及Vc溶液的制备 分别称取Vc及样品A、B、C、D、E和F 6个部位各5 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容，得母液。取适量母液用甲醇稀释配制质量浓度梯度为0.01、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg·mL-1。

2.2.2 DPPH·溶液配制 精密称取DPPH 12 mg于250 mL量瓶中，用甲醇定容，低温避光保存、备用。

2.2.3 自由基DPPH·的清除试验 取2 mL的DPPH·标准液加2 mL甲醇溶液充分混匀，常温避光反应15 min，于517 nm处测量吸光度(A空白)，用各浓度样品溶液代替甲醇测量其吸光度(A样)，阳性对照参照样品方法[6]。按公式(1)DPPH·清除率计算。

DPPH·清除率(%)=(A空白-A样)/A空白×100%

(1)

式中：A空白—2 mL DPPH·溶液与2 mL甲醇的吸光度；A样—2 mL DPPH·溶液与2 mL样品溶液的吸光度。

2.3 抑制肝癌HepG2细胞增殖活性部位筛选

2.3.1 高糖DMEM培养基的配制 500 mL高糖DMEM培养基中加入胎牛血清、青霉素、链霉素，使其含10%胎牛血清，青霉素浓度为100 U·L-1，链霉素质量浓度为100 mg·mL-1。

2.3.2 HepG2细胞的培养 将HepG2细胞置于25 mL塑料培养瓶中，加入以上培养基，置于37 ℃含5% CO2的恒温培养箱内。待细胞生长至90%融合时，用0.25%的胰酶消化传代，3 d传代1次。

2.3.3 MTT法检测细胞相对存活率 将HepG2细胞以1×104个/每孔的密度接种于96孔板中，培养12 h使细胞充分贴壁。弃去培养基，分别加入不同浓度的文冠果壳的A、B、C、D、E和F提取部位。在细胞培养结束前4 h，每孔加入15 μL的MTT。培养结束后，吸去培养基，每孔加入150 μL的DMSO，37 ℃震荡10 min，用多功能酶标仪检测450 nm处的吸光度值(A)[7]。

3 结果分析

3.1 文冠果壳抗氧化活性部位的筛选

图1 文冠果壳活性部位清除DPPH·自由基作用

由图1可知，文冠果壳的A、B、C、D、E、F 6个不同溶剂提取部位对自由基DPPH·都显示出了一定的清除效果，且有较好的量效关系，随着提取物浓度的升高，对自由基DPPH·的清除效率也越高。其中，提取物E相比于A、B、C、D、F具有更好的清除活性，当提取物E的质量浓度为0.2 mg·mL-1时，其对自由基DPPH·的清除率高达70.82%。

3.2 文冠果壳不同提取部位抑制肝癌HepG2细胞增殖实验

由图2可知文冠果壳的A、B、C、D、E、F 6个不同溶剂提取物对HepG2细胞增殖均有一定的抑制作用，并且呈现出较好的量效关系，其中提取物E、F相比于A、B、C、D具有更好的生物活性。提取物F在低浓度时对HepG2细胞有促进生长和增殖作用，而当提取物质量浓度为75 μg·mL-1时对HepG2增殖的抑制率高达70.1%。

注：A.水提取物；B.10%乙醇提取物；C.30%乙醇提取物；D.50%乙醇提取物；E.70%乙醇提取物；F.95%乙醇提取物。图2 文冠果壳活性部位对HepG2细胞增殖的影响

4 讨论

本文文冠果壳不同质量浓度的乙醇提取物抗氧化活性和对HepG2癌细胞的细胞毒性实验表明，70%乙醇提取物的清除自由基DPPH·效果最强，当其质量浓度为0.2 mg·mL-1时，其对DPPH·清除效率高达70.82%；95%提取物对癌细胞的细胞毒性作用最强，其质量浓度为75 μg·mL-1时，对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制率高达70.1%。

文冠果在陕西、甘肃、辽宁、山西等地区已经有大规模的栽培，而且国家林业部在2015年底及2016年初分别在陕西省咸阳市及北京召开了文冠果产业发展助推大会，足见国家对该树种的重视。目前，相关企业及研究机构对文冠果资源的开发以种仁榨油为主，而占果实总重超过50%的文冠果壳几乎没有被开发利用，被当作废弃物丢弃。因此本研究内容及结果将对文冠果壳的资源化利用、文冠果资源的综合开发及提高文冠果产业的经济附加值具有一定的指导意义。

[1] 尚宏芹.文冠果提取物药理作用研究进展[J].动物医学进展，2010，31(6)：103-106.

[2] 王颖，姜生，孟大利，等.文冠果的化学成分与生物活性研究进展[J].现代药物与临床，2011，26(4)：269-273.

[3] 毛迪锐，姜贵全，张卓睿，等.文冠果壳总皂苷超声波辅助提取工艺优化[J].食品与机械，2014，30(2)：170-174.

[4] Ma Chaomei，Nakamura N，Hattori M，et al.Inhibitory effects on HIV-1 protease of constituents from the wood of Xanthoceras sorbi-folia[J].J Nat Prod，2000，63(2)：238-242.

[5] 刘新霞，杨新爱，屈婵，等.文冠果果壳提取物对学习记忆障碍的改善作用[J].中药新药与临床药理，2007，18(1)：23-25.

[6] 卜令娜，张佳，徐月敏，等.油橄榄叶清除自由基活性部位筛选[J].食品工业，2013，34(6)：131-134.

[7] 唐渊，李晓辉.莪术提取物对肝癌细胞系HepG2的抗癌作用及机制研究[J].中国药理学通报，2007，23(6)：790-794.

AntioxidantActivityofFruitShellsofXanthocerassorbifoliaandScreeningofActiveComponentsInhibitingProliferationofHepG2CellLines

ZHANGYanlei*，XIAOHongfei，SHIHuanxian，SONGZhongxing，TANGZhishu

(ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofIndustrializationofTraditionalChineseMedicineResources；ShaanxiKeyLaboratoryofNewDrugsandBioactiveConstituentsofTraditionalChineseMedicine；Xianyang712083，China)

Objective：To screen the activity part of the antioxidant and inhibiting the proliferation of HepG2 cell line from the fruit shells of Xanthoceras sorbifolia.MethodsThe fruit shells ofX.sorbifoliawere extracted by water，10%，30%，50%，70% and 95% ethanol aqueous，respectively，and obtained six different parts named as A，B，C，D，E and F.These fractions were assayed by scavenging the DPPH· free-radical to determine their antioxidant activity and inhibiting the proliferation against HepG2cell line by MTT method.ResultsAll the extracts of the fruit shells ofX.sorbifoliashowed the antioxidant activity and inhibiting the proliferation of HepG2cells.Among them，part D(the extract of 70% ethanol aqueous)showed the strongest activity for scavenging the DPPH free-radical，and when its concentration was 0.2 mg·mL-1，the capacity of antioxidant activity could go up to 70.82%.While the part E possessed the best anti-proliferation activity against HepG2cells，and its inhibition reached 70.10%.ConclusionIn this paper we studied the anti-proliferation activity against HepG2cells and antioxidant activity of different solvent extract from the fruit shells ofX.sorbifolia，and provided the theory basis for potential use of the fruit shells ofX.sorbifolia.

Shells of Xanthoceras sorbifolia ;antioxidant; Inhibiting proliferation;screen

陕西省协同创新计划项目(2015xt-52)；陕西省科技统筹创新工程计划项目(2016KTTSSF01-06-01)

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张严磊，博士，讲师，研究方向:中药资源产业化研究与开发；E-mail：nwuzyl@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.015

2017-03-01)