ROS/ALOX5/NLRP3信号通路激活在低氧所致肺动脉内皮增殖中的作用

胡 志，马 慧，范粉玲，刘文娟，谢 航

(西安交通大学第一附属医院结构性心脏病科，陕西 西安 710061)

ROS/ALOX5/NLRP3信号通路激活在低氧所致肺动脉内皮增殖中的作用

胡 志，马 慧，范粉玲，刘文娟，谢 航

(西安交通大学第一附属医院结构性心脏病科，陕西 西安 710061)

目的考察ROS/ALOX5/NLRP3信号通路相关蛋白激活在低氧所致肺动脉内皮细胞增殖中的作用。方法将人肺动脉内皮细胞分别在常氧状态(21% O2)和低氧状态(1% O2)下培养24、48、72及96小时，同时低氧状态下分别设立活性氧(ROS)清除剂Trolox组和ALOX5抑制剂齐留通组。采用CCK-8法检测细胞增殖率的改变，活性氧探针H2-DCFA检测低氧状态下肺动脉内皮细胞内ROS的变化，Western blot法分别检测低氧状态及加入Trolox或齐留通干预后ALOX5、NLRP3和Caspase-1蛋白表达的变化。结果肺动脉内皮细胞在低氧作用48、72及96 h后可见增殖显著，分别达(135.6±29.4)%、(185.3±21.7)%及(212.3±39.0)%。同时，细胞内ROS在24、48及72 h可检测到显著增加，96小时后基本恢复正常。ALOX5、NLRP3和Caspase-1蛋白随低氧时间增加而表达增多。预先加入ROS清除剂Trolox和ALOX5抑制剂齐留通均可抑制NLRP3炎性小体相关蛋白NLRP3和Caspase-1的表达，且细胞增殖率也显著降低。结论ROS/ALOX5/NLRP3信号通路在低氧所致的肺动脉内皮细胞增殖中显著激活，抑制这一通路可显著减少低氧所致的内皮细胞增殖。

肺动脉高压；低氧；人肺动脉内皮细胞；NLRP3炎性小体；信号通路

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一种以肺血管循环阻力增加、肺动脉压力持续增高，进而诱发右心衰竭的高致死率和致残率疾病，其病理生理改变以进展性肺动脉压力升高和血管重建为特征[1]。目前虽然机制未明，但临床PAH患者检查发现，低氧所导致的肺泡血管内皮细胞和肺动脉内皮细胞功能不全、异常增殖在PAH的发生发展中起着至关重要的作用[2]。

低氧所诱发的肺动脉内皮细胞增殖机制较为复杂，新近研究资料表明，氧化应激和炎症应答可导致血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)释放，同时促进内皮细胞活化后释放成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors，FGF)，进而改变肺部动脉血管微环境，从而促进肺动脉内皮细胞(pulmonary artery endothelial cells，PAEC)无序增殖，使肺动脉血管狭窄而诱发PAH[3]。但低氧是如何诱发肺动脉内皮增生，期间关联的信号分子及机制还远未阐明。

花生四烯酸5脂氧酶(arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX5)，可催化具有促血管增殖作用的白三烯类物质的生成。文献报道，在PAH动物模型中发现，长期低氧可能伴随ALOX5表达改变[4]。NLRP3，也被称做NALP3(NACHT，LRR and PYD domains-containing protein 3)是由位于1号染色体长臂的NLRP3基因所编码的重要炎症小体，其在低氧所致的肿瘤细胞增殖中起重要作用[5，6]，但其对动脉内皮细胞的促增殖作用还不明确。由于 ROS生成，ALOX5表达及NLRP3激活在低氧导致的肺动脉内皮增殖中的作用尚不清楚，因此本研究试图考察ROS/ALOX5/NLRP3信号通路相关蛋白在低氧所致肺动脉内皮细胞增殖中的变化规律，同时采用活性氧(ROS)清除剂Trolox组和ALOX5抑制剂齐留通来验证这一通路抑制对内皮细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器CCK-8 检测试剂盒购自美国Dojindo Molecular Technologies 公司；活性氧探针2’，7’-二氯荧光素二乙酸盐(2’，7’-dihydrodichlorofluorescein diacetate，H2-DCFDA)购自碧云天生物技术研究所；低氧培养容器(Hypoxia Incubator Chamber购自加拿大Stemcell公司；ALOX5，NLRP3，Caspase-1及GAPDH抗体购自美国CST公司；Thermo MK3型酶标仪产地美国；Olympus IX53 倒置荧光显微镜产地日本。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人肺动脉内皮细胞(Human pulmonary artery endothelial cells，HPAEC)购自美国ScienCell实验室。常规DMEM培养基含10%胎牛血清进行传代培养，20代内用于实验。

1.2.2低氧及药物处理 HAPEC细胞正常培养条件为37 ℃和5% CO2，95% 空气；低氧条件下，将HAPEC细胞置于Stemcell公司的低氧培养容器，培养条件为1% O2，5% CO2，94% N2。为考察ROS清除剂Trolox和ALOX5抑制剂齐留通对细胞增殖的影响，在进行低氧处置前，预先加入10 μmol/L 的Trolox和齐留通。

1.2.3细胞增殖率测定 将96孔板低氧及常氧状态下培养的HAPEC细胞，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，37 ℃下室温孵育2小时后，用酶标仪在450 nm下检测吸光度值。检验结果重复三次取均值(n=3)。

1.2.4细胞内ROS检测 细胞内总ROS测定采用ROS敏感的荧光探针H2-DCFDA进行反应标记。具体方法如下：HPAEC细胞进行ROS测定前，先用PBS液清洗2次，然后加入10 μg/ml的H2-DCFDA溶液按1∶500浓度稀释，37 ℃孵育15 min后，PBS液清洗3次，去除残留的反应液，488 nm下进行荧光激发，荧光分光光度计检测OD值，检验结果重复三次取均值(n=3)。倒置荧光显微镜进行拍照记录。

1.2.5Western Blot分析 将常氧或低氧状态培养不同时间、不同药物处理的HPAEC进行收集，加入细胞裂解液后进行蛋白定量。每组取20 μg蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转至PVDF膜。室温下2%BSA封闭1小时，按不同稀释倍数加入一抗(ALOX5，NLRP3，Caspase-1及GAPDH)，4 ℃ 封闭过夜后PBS清洗3次，加入1：1000稀释的HRP标记二抗室温孵育1小时，ECL显色，常规胶片曝光。Image-Pro Plus Version 6.0 图像分析软件进行灰度分析。检验结果重复三次取均值(n=3)。

1.3统计学方法采用SPSS 16.0 软件进行统计分析。实验结果均以均数±标准差表示，单因素方差分析(ANOVA)，组间比较采用t检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1低氧对肺动脉内皮细胞增殖率的影响肺动脉内皮细胞在低氧作用48、72和96小时后可见增殖显著，增殖率分别达(135.6±29.4)%、(185.3±21.7)%和(212.3±39.0)%，与常氧对照组比较，差异有统计学意义。见图1。

图1 低氧对肺动脉内皮细胞增殖率的影响(n=3) 与常氧组比较，*P < 0.05，**P < 0.01

2.2低氧对肺动脉内皮细胞ROS生成的影响图2 A为荧光分光光度法检测肺动脉内皮细胞内ROS的生成变化(n=3)；图2B为常氧组及低氧24、48、72及96小时ROS探针H2-DCFDA激发后的荧光照片。结果可见，低氧作用24、48及72小时可见细胞内ROS生成显著增多，分别达(164.38±19.75)%、(196.31±36.02)%及(272.74±31.77)%，与常氧对照组比较差异有统计学意义。见图2。第96小时细胞内ROS基本恢复正常。

2.3低氧对肺动脉内皮细胞ROS/ALOX5/NLRP3信号通路相关蛋白表达的影响随着低氧作用时间的延长，ALOX5蛋白在第48、72及96小时出现显著上调，而炎症小体相关蛋白NLRP3和Caspase-1的表达上调在早期(第24小时)已开始出现。见图3。

图2 低氧致肺动脉内皮细胞ROS生成增加 a：荧光分光光度法检测肺动脉内皮细胞内ROS的生成变化(n=3)；b：常氧组及低氧24、48、72及96小时ROS探针H2-DCFDA激发后的荧光照片。与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01

图3 低氧对肺动脉内皮细胞ROS/ALOX5/NLRP3信号通路相关蛋白表达的影响 a：Western Blot法检测低氧状态下24、48、72及96小时后ALOX5、NLRP3和Caspase-1蛋白表达的变化，内参蛋白为GAPDH；b：Image-Pro Plus6.0软件分析ALOX5蛋白表达量(n=3)；c：Image-Pro Plus6.0软件分析NLRP3和Caspase-1蛋白表达量(n=3)。与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01

2.4Trolox和齐留通对ROS/ALOX5/NLRP3信号通路蛋白的干预及对HPAEC增殖的影响图4a为Trolox和齐留通对ROS/ALOX5/NLRP3信号通路蛋白的干预作用；图4b为Trolox和齐留通对HPAEC增殖的影响。10 μmol/L的 Trolox和齐留通均能显著下调ALOX5、NLRP3及Caspase-1蛋白的表达，且能抑制低氧所导致的肺动脉内皮细胞增殖。

3 讨论

目前，人们对PAH的病理生理机制尚不明确。长期以来，低氧[7]、酸中毒[8]、肺动脉血管内皮增殖[9]及血管重塑所致的肺泡毛细血管循环阻力增加[10]均被认为是导致PAH的重要危险因素。近年来，随着对PAH发病机制的深层次探索，低氧导致的氧化应激损伤、炎性通路激活[11]及诱发的内皮功能障碍逐渐成为新的研究热点和潜在药物作用靶标[12]。

肺血管内皮细胞(PVEC) 在正常生理状态下，其增殖率和凋亡率之间维持着动态平衡，其数量的相对稳定对维持血管正常结构与功能至关重要。但PAH发病中，低氧作为重要的危险因素可引起PVEC增殖率和凋亡率之间失衡，使PVEC数量增多，其产生的促血管生成物质VEGF、FGF及LTs等大量释放，改变肺动脉血管微环境进而导致内膜和平滑肌增厚，使肺血管管腔出现明显狭窄，表现为肺循环阻力持续增大，动脉压力持续升高而发展为PAH[13]。

图4 Trolox和齐留通对ROS/ALOX5/NLRP3信号通路蛋白的干预及对HPAEC增殖的影响 A：ROS清除剂Trolox和ALOX5抑制剂齐留通对ROS/ALOX5/NLRP3信号通路蛋白的干预作用；B：Trolox和齐留通对HPAEC增殖的影响(n=3)。与低氧组比较，##P < 0.01；与常氧组比较，**P < 0.01

近年的研究表明，低氧状态除可促进低氧细胞内ROS生成外，还可能激活下游氧化应激和炎症反应，其中诱发血管生长因子释放的ALOX5蛋白及NLRP3炎症小体的表达规律可能在PVEC增殖中扮演重要作用[14]。为进一步探索低氧诱导动脉内皮增殖的机制，本研究采用人肺动脉内皮细胞作为研究对象，在低氧作用48、72和96 h后可见其增殖显著。同时，细胞内ROS在24、48、72 h显著增加，ALOX5、NLRP3和Caspase-1蛋白随低氧时间增加而表达增多。预先加入ROS清除剂Trolox和ALOX5抑制剂齐留通均可抑制NLRP3炎性小体相关蛋白NLRP3和Caspase-1的表达，且细胞增殖率也显著降低。

本研究结果首先明确了在体外条件下，低氧可促进肺动脉内皮细胞增殖，伴随出现细胞内ROS增多，同时细胞膜脂质调节关键蛋白ALOX5表达增加，炎症蛋白NLRP3和Caspase-1激活，以上结果均说明，肺动脉内皮细胞在低氧条件下的增殖与氧化应激、炎症和脂质代谢紊乱相关。ALOX5的增加可能通过旁分泌方式作用于肺小动脉内膜，引起内膜增厚以及介导新生血管的形成，由此产生明显的肺血管重构。随着病情的发展，将进一步诱发血管中膜和内膜增厚及血管弹性下降，引起血管阻力增加，肺细小动脉肌性化；NLRP3其介导的炎症通路及下游Caspase-1的激活及白介素1β的释放也与动脉内皮细胞炎症反应及增殖关系密切。后续实验中，我们在低氧体系中预先加入ROS清除剂Trolox和ALOX5抑制剂齐留通，恰好抑制了ROS/ALOX5/NLRP3信号通路，同时大大阻断了内皮细胞增殖。因此，我们大致可以推论，ROS/ALOX5/NLRP3信号通路是调节动脉内皮增殖的重要机制之一。

目前改善内皮细胞功能紊乱的药物，如内皮素受体拮抗剂、血管紧张素受体阻断剂、血脂调节药物等已经证明可一定程度改善PAH患者的病情，但由于这些药物副作用较大，目前临床上仍不能作为低氧性PAH的长期治疗手段[15]。因此，寻找新的针对低氧性PAH的有效治疗靶点和新药物势在必行。本研究结果提示，ROS/ALOX5/NLRP3信号通路在低氧所致的肺动脉内皮细胞增殖中显著激活，抑制这一通路可显著减少低氧所致的内皮细胞增殖，但这一信号通路的干预实验尚需在PAH动物模型中验证，其后续是否可作用药物调控的靶点从而形成新的治疗手段，还有待进一步深入研究。

[1] Humbert M，Morrell NW，Archer SL，et al.Cellular and molecular pathobiology of pulmonary arterial hypertension[J].Journal of the American College of Cardiology，2004，43(12 Supplement)：S13-S24.

[2] Xu W，Kaneko FT，Zheng S，et al.Increased arginase II and decreased NO synthesis in endothelial cells of patients with pulmonary arterial hypertension[J].The FASEB journal，2004，18(14)：1746-1748.

[3] Morrell NW，Adnot S，Archer SL，et al.Cellular and molecular basis of pulmonary arterial hypertension[J].Journal of the American College of Cardiology，2009，54(1 Supplement)：S20-S31.

[4] Thompson AR.，Lawrie A.Targeting vascular remodeling to treat pulmonary arterial hypertension[J].Trends in molecular medicine，2017，23(1)：31-45.

[5] Ravichandran P，Liu HZ，Choubey D.Hypoxia primes human normal prostate epithelial cells and cancer cell lines for the NLRP3 and AIM2 inflammasome activation[J].Oncotarget 2016，7(19)：28183.

[6] Ghiringhelli F，Apetoh L，Tesniere A，et al.Activation of the NLRP3 inflammasome in dendritic cells induces IL-1β-dependent adaptive immunity against tumors[J].Nature medicine，2009，15(10)：1170-1178.

[7] Semenza GL.Oxygen sensing，hypoxia-inducible factors，and disease pathophysiology[J].Annual Review of Pathology[J].Mechanisms of Disease，2014，9：47-71.

[8] Chang G，Zhang K，Xu T，et al.Feeding a high-grain diet reduces the percentage of LPS clearance and enhances immune gene expression in goat liver[J].BMC veterinary research，2015，11(1)：67.

[9] Kim J，Kang Y，Kojima Y，et al.An endothelial apelin-FGF link mediated by miR-424 and miR-503 is disrupted in pulmonary arterial hypertension[J].Nature medicine，2013，19(1)：74-82.

[10]Perros F，Ranchoux B，Izikki M，et al.Nebivolol for improving endothelial dysfunction，pulmonary vascular remodeling，and right heart function in pulmonary hypertension[J].Journal of the American College of Cardiology 2015，65(7)：668-680.

[11]Magne J，Pibarot P，Sengupta PP，et al.Pulmonary hypertension in valvular disease：a comprehensive review on pathophysiology to therapy from the HAVEC Group[J].JACC：Cardiovascular Imaging，2015，8(1)：83-99.

[12]Perros F，Ranchoux B，Izikki M，et al.Nebivolol for improving endothelial dysfunction，pulmonary vascular remodeling，and right heart function in pulmonary hypertension[J].Journal of the American College of Cardiology，2015，65(7)：668-680.

[13]Yamaji-Kegan K，Takimoto E，Zhang A，et al.Hypoxia-induced mitogenic factor (FIZZ1/RELMα) induces endothelial cell apoptosis and subsequent interleukin-4-dependent pulmonary hypertension[J].American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology，2014，306(12)：L1090-L1103.

[14]Porter KM，Kang BY，Adesina SE，et al.Chronic hypoxia promotes pulmonary artery endothelial cell proliferation through H2O2-induced 5-lipoxygenase[J].PloS one，2014，9(6)：e98532.

[15]Galiè N，Corris PA，Frost A，et al.Updated treatment algorithm of pulmonary arterial hypertension[J].Turk Kardiyoloji Dernegi arsivi：Turk Kardiyoloji Derneginin yayin organidir，2014，42：78-94.

TheeffectofROS/ALOX5/NLRP3signalingpathwayonhypoxia-inducedpulmonaryarteryendothelialcellproliferation

HUZhi，MAHui，FANFen-ling，LIUWen-juan，XIEHang

(DepartmentofStructuralHeartDisease，TheFirstAffiliatedHospital，Xi’anJiaotongUniversity，Xi’an710061，China)

ObjectiveTo investigate the role of activation of ROS/ALOX5/NLRP3 signaling pathway in hypoxia-induced proliferation of pulmonary artery endothelial cells.MethodsThe human pulmonary arterial endothelial cells (HPAEC) were cultured in normoxia (21% O2) and hypoxia (1% O2) for 24，48，72 and 96 hours，respectively.At the same time，subsets of reactive oxygen species (ROS) scavenger，Trolox and ALOX5 inhibitor，Zileuton were set up.The CCK-8 method was used to detect the cell proliferation rate.The change of ROS level in HPAEC under hypoxia was detected by probe H2-DCFA.Western blot was used to detect the expression of ALOX5，NLRP3 and caspase-1 protein after intervention of hypoxia，Trolox and Zileuton，respectively.ResultsHPAEC were significantly proliferated at 48，72 and 96 hours after hypoxia，reaching (135.6±29.4)%，(185.3±21.7)% and (212.3±39.0)%，respectively.At the same time，intracellular ROS at 24-，48-and 72-hour was increased significantly and return to normal at 96 hour.The protein expressions of ALOX5，NLRP3 and caspase-1 were increased with the prolonged hypoxia time.Pretreatment with Trolox and Zileuton inhibited the expressions of NLRP3 and caspase-1 in the inflammasome，and the cell proliferation rate was decreased significantly.ConclusionROS/ALOX5/NLRP3 signaling pathway is significantly activated in hypoxia-induced proliferation of HPAEC，and inhibition of this pathway can significantly reduce hypoxia-induced endothelial cell proliferation.

Pulmonary arterial hypertension；Hypoxia；Human pulmonary artery endothelial cells；NLRP3 inflammasome；Signaling pathway

陕西省自然科学基础研究基金面上项目(编号:2014JM2-8171)

R563

A

1672-6170(2017)06-0044-05

2017-07-21；

2017-09-22)