固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱同时检测动物源性食品兽药残留

杨 昊

（山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250000）

固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱同时检测动物源性食品兽药残留

杨 昊

（山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250000）

利用固相萃取-高效液相色谱-串联质谱方法对喹诺酮类与青霉素类2类15种兽药在动物源性食品中的残留情况进行检测。样品经丙醇-乙酸乙酯（5∶5）提取，由不经活化的prime HLB固相萃取柱净化，使用甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）作为流动相，电喷雾离子源分段多反应监测扫描模式检测。15种兽药检出限为0.5～2.0 μg/kg，定量限为2.0～5.0 μg/kg，各基质中回收率为71.3%～96.5%，相对标准偏差为2.1%～9.2%。采用此方法，能有效提高多残留兽药的检测效率，可良好应用于食品安全问题中兽药残留的快速分析。

固相萃取；超高效液相色谱-串联质谱法；兽药残留；动物源性食品

近年来，兽药（含饲料药物添加剂在内）在畜牧业的应用愈发广泛，动物性食品中的兽药残留现象亦日益发展为很多人共同关注的一个社会焦点[1]。

当前，对违禁药物予以非法使用、滥用抗菌药物及药物添加剂等行为均已成为我国动物源性食品中兽药残留超标、畜禽产品消费不安全等的主要原因之一。基于对兽药性质差异明显，当前残留分析大多采用类似于化学类结构的同组药物进行相应方法的开发、多类残留的同时检测报道较少、检测周期长、成本高、效率低[2]等因素的考虑，为增加药物分析的种类，满足多类兽药风险筛查与检测工作的需求，应加强现代农药检测领域中关于不同类别农药多残留问题的检测，完善检测方法与基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

实验过程所用仪器包括：Qasis Prime HLB200mg/6ml固相萃取柱、Acquity UPLC液相色谱仪、Xevo TQ-S质谱仪、Thermo XIR高速冷冻离心机、Milli Q超纯水系统、GM200刀式研磨仪以及ENVI氮吹仪等。实验所用试剂有：甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯）以及15种兽药标准品（喹诺酮类12种、青霉素类3种）[3]。

1.2 样品制备

为了满足样品的均质[4]要求，需对其进行去脂处理，以此为前提，称取2.00 g样品放入材质为聚四氟乙烯的离心管中，加入10 mL乙酸钠-乙酸缓冲液（浓度为0.2 mol/L，pH值为5.2），待其充分涡旋呈均质状态后，加入 50μL β-葡萄糖醛苷酶进行振荡酶解，保持温度为 37 ℃，振荡速度 200 r/min，整个酶解过程不能小于 6 h。完成酶解作业后，取出并将其冷却至室温水平，以1 000 r/min的速度进行10 min涡旋，之后将所有的上清液取出来，放到一个新的离心管中，滴入氢氧化钠溶液（浓度为10 mol/L）对其pH值进行调节，直至达到11.0的水平。然后，加入异丙醇-乙酸乙酯溶液（满足体积比为5:5）与饱和氯化钠溶液各10 mL，完全涡旋提取（该操作时间为10 min），以10 000 r/min的速度做离心处理，将分离后的上层有机相清液取出来，用氮气吹干（温度保持在40 ℃）。最后，加入5 mL乙酸钠-乙酸缓冲液对残差进行充分溶解，上柱。

用3 mL甲醇与3 mL水对柱后样液（规格为25 mg/10mL）进行活化处理，待其溶解后全部上柱，将流速控制在1滴/s，顺序采用3 mL水、3 mL甲醇水溶液（浓度为60%）以及1 mL甲醇将MIP柱清洗干净，之后，对其进行真空负压抽干处理，用2mL甲醇溶液洗脱，控制流速于1滴/s的水平上。

之后，对洗脱液进行收集，用微弱氮气流将其吹干（保持温度在40 ℃），用1 mL初始比例流动相复溶，过亲水性聚丙烯膜（厚度为0.2 μm），待测。

表1 5种兽药中代表性化合物的多反应监测离子对与质谱参数（简表）Table 1 The multi-reaction monitoring ions pairs and mass spectrometric parameters of representative compound in five veterinary drugs(simple list)

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱条件

柱温恒定为35 ℃；流速为0.45 mL/min；液相色谱柱为Water Acquity UPLC BEHC18；流动相A为甲醇，流动相 B为乙酸铵水溶液（规格为 5 mmol/L，含0.1甲酸）；进样量为10μL。梯度顺序如下：0～5 min，95%～80% B；0.5～10 min，80%～60%B；1.0～2.5 min，60%～40% B；2.5～3.0 min，40% B；3.0～3.5 min，40%～1% B；3.5～4.5 min，1% B；4.5～5.0min，1%～95% B；5.0～6.0 min，95% B。

1.3.2 质谱条件

选用电喷雾离子源（ESI），以正离子方式进行扫描、动态多反映监测方式进行监察与测量（各质谱扫描窗口为对应化合物保留±0.5 min的时间），毛细管电压为800 V，脱溶剂气温度与气流量分别为450 ℃与800 L/h，锥孔气流量150 L/h，雾化气压力7.0 bar。表1所示为其他相关参数。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

采用如上所述实验方法，测定后的混合标准溶液色谱图如图1所示。

2.2 仪器与工作参数的选择

以BEHC18超高效液相色谱柱为分离介质，采用流动注射方法，对移取的溶液分别在电喷雾正模式下进行母离子与子离子两种扫描，为提高灵敏度至最佳水平，还要对去簇电压与碰撞气电压等参数予以优化。以不同溶液作为流动相，对化合物的分离情况、峰值以及响应值大小进行考察。结果发现：因接受正离子模式检测，在流动相中加入酸能够对信号响应予以增强，缓冲盐的加入则有利于峰形的变化。所以，最终选择的流动相为甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液，其中，乙酸铵水溶液中含有0.1的甲酸。

图1 15种兽药的动态多反应监测色谱图Fig.1 The dynamic multi-response monitoring chromatogram of fifteen veterinary drugs

2.3 提取与净化条件选择

2.3.1 提取方式选择

对于多残留检测，目标化合物的前处理方式十分重要。此次试验中检测的兽药化学结构普遍存在亚氨基等功能团，容易溶于甲醇等极性溶剂中，在水溶液中通常呈现弱碱性。在取代集团的作用下，化合物之间存在比较明显的性质差异，即使它们属于同族药物，pKa也会有较大的不同。举例而言，硝基咪唑类化合物的pKa值通常在2.8～11.4之间，这说明它有一些中性与偏酸性药物，故样品前处理难度会比较大。实验优化了多种溶剂种类，并对搭配比例不同的处理效率进行了对比分析。结果显示，乙腈的提取效率较低，而乙酸乙酯与异丙醇对不同化合物的分配又各不相同，致使配比不同的情况下得到的提取效率也存在相应的差异，经过进一步考察，在综合考虑所有化合物的前提下，做出以异丙醇-乙酸乙酯（5∶5）进行提取的最终选择。

2.3.2 固相萃取方式的选择与优化

由于目标化合物有不同的极性，且对不同固相萃取柱的适应性也存在差异，为在所有的化合物中予以应用，所选择的固相萃取柱应符合极性吸附原理，经净化处理，不仅可以去除磷脂、蛋白质等杂志，还能够最小化净化处理对化合物产生的负面影响。在HLB亲水亲脂平衡柱的基础之上，Prime HLB会在相应地增强干扰物的效果，同时，优化筛板，避免堵塞状况的出现。实现对不同亲水亲脂平衡柱进行对比研究，结果表明，prime HLB在降低杂质干扰中的效果最为明显，对于某种相对比的喹诺酮类、青霉素类化合物而言，会有更高的回收率。

2.4 方法学验证

2.4.1 基质效应

从原理上看，液相色谱-质谱分析中的基质效应不能完全消除[5]，一般会通过稀释法、标准加入法、内标法、阴性基质匹配标准溶液对基质效应造成的误差进行修正或削弱。本实验采用优化梯度洗脱程序与阴性基质匹配标准溶液法对基质效应予以抵消。

表2 15种兽药线性范围、方程、相关系数、检出限与定量限表Table 2 The linearity range, equation, coefficient association, LOD and LOQ of fifteen veterinary drugs

2.4.2 线性关系与检出限

依照以上条件，将混合标准工作溶液上机测定，在制作标准工作曲线之时，横坐标用以表示质量浓度，纵坐标则用于表示峰面积。结果显示，接受检测的兽药在对应浓度范围内线性比较好。通过定量子离子的3倍信噪比进行检出限（LOD）的计算，10倍信噪比则用于定量限（LOQ）的计算，加入标准物质测定，得到如表2所示结果。由表可知，兽药 LOD 为 0.5～2.0 μg/kg，LOQ 为 2.0～5.0 μg/kg，灵敏度能够对实际样品检测所需予以满足。

2.4.3 回收率与重现性

在猪肉、鱼肉中分别添加3个不同浓度的混合标准溶液，对它们进行6次回收率实验，结果显示，所测化合物在猪肉、鱼肉中的回收率维持在71.3%～96.5%的水平内，相对标准偏差（RSD）在2.1%～9.2%的范围内，表明该方法的精密度较高，可对实际样品的检测所需予以满足。

2.5 实际样品测定

采用实验所用方法，对市场中销售的猪肉、鱼肉共 20份进行快速筛查。与国家标准方法GBT20366-2006及GBT21312-2007进行比较，所得测定结果大体相同，这意味着该方法能够应用于动物源食品中兽药残留的快速筛查与定量测定。

3 结 论

为预防、治疗与诊断动物疾病，或有目的地对动物生理机能进行调节，我国很多畜牧业经营企业都开始使用多种类兽药。消费者在不知情的情况下食用动物源性食品后，残留在食品中的兽药成分短期内可能不会对人体产生影响，但长期、大量的食用会对其肝、肾、心脏等器官造成巨大损伤[6]。为有效解决上述问题，避免消费者因食用含兽药残留类动物源性食品而引致生理机能受损现象的发生，实验提出一种具体的检测方法：固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱同时检测法，对猪肉、鱼肉中15种兽药的残留情况进行检测。固相萃取法具有快速与简便优势，较之标准方法与已有报道，可减少活化、淋洗等耗时较多的环节，有效缩短样品处理时间。经验证，固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱方法在测定低限、回收率以及精密度等方面均能对残留检测需求予以满足，在动物源性食品中兽药残留的检测中适用性较高。

［1］郭德华，邓晓军，赵善贞，等.固相萃取-高效液相色谱/串联质谱同时检测动物源性食品中76种兽药残留[J].分析化学，2010（3）：318-324.

［2］陈刚，邓晓军，孙锦兰，等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物源性食品中35种兽药残留量[J].理化检验-化学分册，2014（7）：809-814.

［3］郝杰，姜洁，余建龙，等.固相萃取-超过效液相色谱-串联质谱法同时测定动物源性食品中多种兽药残留[J].食品科学，2017（12）：266-272.

［4］郝杰，姜洁，邵瑞婷，丁学妍，史娜，路勇.分子印迹固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物源性食品中11种β-受体阻断剂残留[J].分析测试学报，2016（10）：1278-1282.

［5］王京，王庆龄，叶佳明，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物源食品中30种兽药残留[J].分析实验室，2016（8）：955-960.

［6］朱捷，何微，马桂娟.HPLC-MS/MS法同时测定补肾壮阳类保健食品中非法添加11中化学药成分[J].当代化工，2015（11）：2729-2732.

Simultaneous Determination of Veterinary Drug Residues in Animal-origin Food by Solid Phase Extraction-Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

YANG Hao
（Shandong Food and Drug Inspection Institute,Shangdong Jinan 250101, China）

15 Kinds of veterinary drug residues in animal-origin food were detected by solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry. Samples were extracted by acetone-ethyl acetate, and were purified by a prime HLB solid phase extraction column. The eluate was detected by multiple reaction monitoring scanning with electronic spray ionization. The limits of quantitation for 15 veterinary drugs were in the range of 2.0～5.0 μg/kg, as well as the detection limits were 0.5～2.0 μg/kg. Recoveries from different food matrices were 71.3%～96.5% with relative standard deviations between 2.1%～9.2%. This method is significantly efficient in the determination of multiple veterinary drugs and suitable for rapid analysis of veterinary drugs.

Solid phase extraction; UPLC-MS/MS; Veterinary drug residue;Animal-derived food

O 657.63；O 657.7+2；O 658.2

A

1671-0460（2017）11-2386-03

2017-09-01

杨昊（1986-），男，山东省乐陵市人，工程师，研究方向：食品中农药兽药残留在液相色谱质谱中检测方法研究。