原料乳中菌落总数检测技术综述

文/房启波 于春艳

原料乳中菌落总数检测技术综述

文/房启波1于春艳2

（黑龙江摇篮乳业股份有限公司）

原料乳中菌落总数的控制对后续产品质量的保证至关重要，近年来随着微生物检测技术的快速发展，菌落总数的测定不仅仅限于传统微生物法，目前可以采用快速检验的方法也有很多，综述了平板菌落计数法、美蓝（亚甲蓝）试验、菌落总数测试片检测、自动化仪器分析等原料乳中菌落总数的检测方法。

原料乳；菌落总数；检测方法

牛乳是改善营养、增强体质的优质食品。牛乳富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质和水六大成分，成分均衡，是营养价值非常高的食品，因此常喝牛乳对身体非常有益。

牛乳本身所含有的极其丰富的营养物质，也是微生物最好的培养基，因此原料乳极易受到微生物的破坏，从原料乳挤出到运输、加工，每一个环节都不可避免地受到微生物的污染。原料乳一旦受到微生物的污染，将会对产品质量产生巨大的影响。原料乳中微生物数量过多会导致原料乳杀菌不彻底，成品残留菌量超标，产品容易变质，保质期不能保证，也给消费者的健康带来一定的隐患，因此监测好原料乳的微生物指标至关重要。

原料乳中微生物检测最直接的方法是测定菌落总数，GB 19301-2010《食品安全国家标准 生乳》微生物限量中，对原料乳的菌落总数提出了限量要求。

1 菌落总数测定的意义

菌落总数是用于判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，是原料乳重要的微生物控制指标之一，其在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣，反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出恰当的卫生学评价。

近年来，随着科学技术的不断进步，微生物检测技术也迅猛发展，传统的菌落总数检测方法虽然精确度高，但繁琐、费时，其最大的弊端是不能实现实时监测，48 h之后才能得到原料乳菌落总数的检测结果，无法根据原料乳的质量来指导生产。为了更好地控制原料乳的菌落总数，各企业和质检机构在传统检测方法的基础上，也引入了一些可实时监控的快速检测新技术、新仪器，通过新技术、新材料的应用，杜绝了不合格原料乳的投入使用，对生产更具指导意义。

2 检测方法综述

2.1 平板菌落计数法

2.1.1 定义

食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。

2.1.2 设备和材料

恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、天平、均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器、无菌锥形瓶、无菌培养皿、pH计、放大镜或菌落计数器。

2.1.3 培养基和试剂

平板计数琼脂培养基，无菌生理盐水。

2.1.4 检验方法

无菌移取25 mL样品置于盛有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。无菌移取1∶10 样品匀液1 mL于盛有9 mL稀释液的无菌试管中，混合均匀制成1∶100的样品匀液。按照上述步骤，制备10 倍系列稀释样品匀液。根据对样品污染状况的估计，选择2～3 个适宜稀释度的样品匀液，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿中，及时将15～20 mL样品匀液冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后将平板翻转，（36±1）℃培养（48±2）h。菌落计数时可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（Colony-Forming units，CFU）表示，再乘以相应稀释倍数，作为每mL样品中菌落总数结果。

平板菌落计数法速度慢，但重复性、平行性很好，是经典的计数法。

2.2 美蓝（亚甲蓝）试验

美蓝试验又称美蓝还原褪色试验，是用于测定原料乳菌落总数的一种定性试验：将1 mL亚甲基蓝溶液加入到20 mL原料乳中，混匀后放入38～40 ℃恒温箱中，经过20 min、2 h和5.5 h，观察3 次褪色情况，根据褪色时间可以间接推断出原料乳菌落总数的大致范围，并将原料乳分为4 个等级。分级情况见表1。

美蓝是一种氧化还原作用指示剂，在厌氧环境中其将被还原为无色。如果原料乳中有细菌生长繁殖，必将造成其中溶解氧含量的减少，原料乳样品中的氧化还原电势降低，通过美蓝颜色变化的速度，可以鉴定该原料乳的质量。

美蓝试验优点是操作简便，不需要特殊设备，但不能作为定量检查方法。

2.3 菌落总数测试片

菌落总数测试片可以检测原料乳中的菌落总数，快速、简便，目前广泛应用于各企业和检测机构。其原理是：测试片为预先制备好的培养基系统，测试片上的培养基含有冷水可溶性凝胶和指示剂，菌落总数测试片中含有的指示染剂可使菌落显示红色，在接种样品并经过一定时间的培养后，根据计数测试片所在区域的红色菌落的数量来判定样品的菌落总数。

和传统方法相比较，该测试片操作简便、迅速，减少了实验室制备培养基等大量准备工作，检测时只需要把稀释液垂直滴加在测试片的中央处，重新水化的培养基便可作为微生物生长的支持物，经过培养后，便可像常规平皿计数一样直接在膜系统上对菌落进行计数。实践证明，测试片方法的检测结果与平板计数法检测结果比较差异性小，方法准确度高。

2.4 自动化仪器分析

近年来，微生物的快速检测和自动化研究进展迅速。与传统方法相比，具有更快、更方便、更灵敏的特点。

其中，丹麦福斯公司生产的牛奶细菌总数测定仪BactoScan 8000S，采用流式细胞技术原理，直接对细菌DNA进行染色计数。即应用激光源照射经过DNA染色和流体技术处理的排成列通过的单个细菌，然后采集每个细菌阻断激光束时产生的频率信号，对该频率信号进行自动计数，从而实现无需培养样品、实时检测、自动计数和直接得到细菌总数的结果。该仪器自动化程度高，易于操作，稳定性好，分析速度快，时效性优于传统平板培养法，平均1 min即可得到检测结果，适合企业大批量实时检测。

此外，ATP荧光细菌检测仪因其成本低廉、小巧便携，应用也较为广泛，其在测量时先对样品进行前处理，利用试剂使细菌细胞的ATP发光，然后根据光敏传感器对样品光亮程度的测定，来换算细菌的数量。其原理是，ATP是包括细菌在内的所有生物细胞中的能量分子，只要测定出样品中细菌细胞的ATP含量，即可用标定的方法换算出细菌数量。

表1 原料乳分级情况

除了上述两种检测方法外，还有智能化图像识别系统、PCR技术、电导微生物技术等，均可很好地检测出原料乳菌落总数含量，但检测成本较高。

3 小结

本文介绍了几种常用的测定原料乳菌落总数的检测方法，工作中可以根据实际情况结合使用来控制原料乳的质量，指导生产。

随着科学技术的不断发展，今后将有更多先进的新技术和新方法涌现出来，这些检测手段的应用，必将为原料乳质量控制工作提供有力的技术支持和保障，提高原料乳检验的效率和控制水平，提升产品品质和企业竞争力。

[1] 王惠霞，张丽. 乳类产品营养价值浅析[J]. 中国乳业，2002（12）：23-24.

[2] 张名爱，李洁慧，于翠芳，等. 原料乳中菌落总数检测方法的比较研究[J]. 饲料工业，2013，34（5）：49-52.

[3] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局. GB 4789.2-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定[S]. 北京：国家标准出版社，2016.

[4] 国家标准化管理委员会. GB 5409-85牛乳检验方法[S]. 北京：国家标准出版社，1985.

[5] 陈燕飞. 牛乳中细菌的检查[J]. 中国农学通报，2008，24（2）：121-124.

[6] 洪梓申. 原料奶控制：源头把关莫放松[J]. 食品安全导刊，2008（2）：36-37.

[7] 嵇志远. 3M Petrifilm测试片法检测水中菌落总数[J]. 中国给水排水，2010，26（14）：119-121.

[8] 赵化平，刘刚，赵秀忠. 原奶细菌总数快速检测技术的新进展[J]. 中国乳制品工业协会第十三次年会论文集，2007：321-323.

[9] 田丽萍，吴志良，孟庆红. 两种原料乳细菌总数检测方法的比较[J]. 乳业科学与技术，2011（2）：77-78.

[10] 张志洁，韩剑众. 食品微生物快速检测技术及其自动化研究进展[J]. 食品研究与开放，2003，24（2）：97-100.

2017-08-15）

百奥明中国无锡工厂开业典礼暨2017亚洲营养论坛在无锡举行

【本刊讯】（记者 张俊妍 祝文琪）2017年10月30日，百奥明中国无锡工厂开业典礼在无锡隆重举行。百奥明母公司Erber集团和百奥明公司创始人Erich Erber，奥地利驻上海总领事馆商务处商务领事薛珊，奥地利驻上海总领事馆商务处商务副领事孔丽莎，奥地利驻上海总领事馆商务处高级市场专员胡宗延，Erber集团CEO、董事会主席Jan Vanbrabant，百奥明公司CEO Hannes Binder，百奥明亚太区CEO Marc Guinnement，百奥明中国总经理安纲以及各地企业、事业单位代表、媒体记者共500 余人参加开业典礼。此外，为了探索推动亚洲蛋白质经济未来的因素，有效推动亚洲蛋白质经济，百奥明公司于31日举办2017亚洲营养论坛，汇集全球行业知名专家，对家禽、生猪和奶牛生产等行业热门话题和发展趋势进行深入探讨。

百奥明公司于1983年在奥地利成立，客户遍布120 多个国家，拥有来自38 个国家的770 名员工，同约200 所院校及研究机构创建研究网络，在全球共建有11 处生产场址。百奥明专注于以天然、高效益的方式促进动物健康，通过采用先进的专利技术，研发和生产饲料添加剂、预混料、提供技术服务，向畜禽、反刍与水产养殖业提供自然、可持续且可盈利的解决方案。尤其是三十多年来一直致力于霉菌毒素的研究，为降解各种霉菌毒素提供了有针对性的创新解决方案。

房启波（1978-），男，工程师，主要从事乳品生产和质量管理工作。