α-地中海贫血/精神发育迟滞综合征X 染色体相关基因的表达及1p/19q 遗传学改变在星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤及少突星形细胞瘤诊断中的意义

郅 程，赖妙玲，郝卓芳，梅开勇，欧阳小明，翁洁玲，钟 玲，唐 甜，李丽娜

广州医科大学附属第二医院病理科，广东 广州 510260

α-地中海贫血/精神发育迟滞综合征X 染色体相关基因的表达及1p/19q 遗传学改变在星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤及少突星形细胞瘤诊断中的意义

郅 程，赖妙玲，郝卓芳，梅开勇，欧阳小明，翁洁玲，钟 玲，唐 甜，李丽娜

广州医科大学附属第二医院病理科，广东 广州 510260

目的探讨a-地中海贫血/精神发育迟滞综合征X染色体相关基因（ATRX）的表达及1p/19q遗传学改变在星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤及少突星形细胞瘤诊断中的意义。方法星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤及少突星形细胞瘤共53例，采用免疫组化及荧光原位杂交技术检测ATRX的表达及染色体1p/19q分子遗传学改变。结果星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤及少突星形细胞瘤中ATRX突变率（ATRX表达为阴性）分别为60.0%、44.4%及50.0%；星形细胞瘤染色体1p及19q单缺失和1p/19q共缺失率均为0%，少突胶质细胞瘤缺失率分别为54.5%、0%和45.5%，少突星形细胞瘤缺失率分别为12.5%、0%和0%，少突胶质细胞瘤染色体1p/19缺失率（包括共缺失及单缺失）与非少突胶质细胞肿瘤（包括星形细胞瘤及少突星形细胞瘤）比较差异有统计学意义（P=0.032）。联合检测ATRX表达及1p/19q缺失情况，少突星形细胞瘤与星形细胞瘤及少突胶质细胞瘤比较差异有统计学意义（P=0.046，P=0.003）。结论染色体1p/19q缺失主要发生在少突胶质细胞瘤中，对少突胶质细胞瘤的诊断具有重要价值；少突星形细胞瘤与星形细胞瘤的遗传学分子改变具有一定的差异性。

星形细胞瘤；少突胶质细胞瘤；少突星形细胞瘤；a-地中海贫血/精神发育迟滞综合征X染色体相关基因；1p/19q；免疫组化；荧光原位杂交

2015年，基于中枢神经系统（CNS）肿瘤的分子学特征，世界卫生组织对CNS肿瘤的分类进行了新的修订（2016版）[1]，较2007版从概念到实践都有提升[2]。在2016版CNS肿瘤分类中，对于胶质瘤的诊断与鉴别诊断，确定了分子标志物在分类诊断中的重要意义。其中，异柠檬酸脱氢酶（IDH）、α-地中海贫血/精神发育迟滞综合征X染色体相关基因（ATRX）和1p/19q等3个分子标记物对于诊断及其判断预后非常重要[3]。此外，2016版分类标准中，少突星形细胞瘤的诊断存在巨大争议。新分类强调，组织学上同时含星形细胞和少突胶质细胞两种成分的胶质瘤，需要进行肿瘤基因检测后归为星形细胞瘤或少突胶质细胞瘤。然而，在日常的诊断工作中，根据世界卫生组织推荐的分子标记物对少突星形细胞瘤进行重新分类，仍会出现问题。因此，本实验将通过检测星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤及少突星形细胞瘤组织中ATRX的表达及1p/19q的缺失情况，研究少突星形细胞瘤与星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤在分子遗传学方面的差异，从而为今后对少突星形细胞瘤的诊断提供帮助。

1 资料与方法

1.1 研究资料

组织来自广州医科大学附属第二医院病理科2010～2015年间病理石蜡确诊标本53例，患者术前均未接受放疗或化疗。按2007年版“WHO中枢神经系统肿瘤的病理分类”，样本情况如下：星形细胞瘤25例（WHOⅡ级14例，WHOⅢ级11例），少突胶质细胞瘤18例（WHOⅡ级7例，WHOⅢ级11例），少突星形细胞瘤10例（WHOⅡ级2例，WHOⅢ级8例）。标本用10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋。

1.2 方法

1.2.1 ATRX免疫组化检测 （1）常规切片脱蜡并水化；（2）过氧化氢去离子水作用10 min；（3）pH 6.0柠檬酸盐高压修复5 min；（4）滴加ATRX（克隆号：HPA00-1906，Sigma-Aldrich，稀释度：1：50），4 ℃过夜；（5）滴加二抗并室温下作用30 min；（6）DAB显色10 min；（7）苏木素复染、脱水、透明，中性树胶封片。组织中的非肿瘤细胞作为阳性对照，另外用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.2 1p/19q荧光原位杂交 标本经常规处理后，切3～4 μm石蜡切片，采用荧光原位杂交 1p/19q双色探针试剂盒（LS I1p36/1q25 and LSI19q13/19p13双色探针购于北京金菩嘉医疗科技有限公司）检测肿瘤中1p/19q杂合性缺失。

1.3 结果判断

1.3.1 ATRX免疫组化检测结果判断 ATRX表达于肿瘤细胞的细胞核。肿瘤细胞的细胞核为棕黄色颗粒样染色，即判为肿瘤细胞阳性。如组织内的肿瘤细胞核没有染色，但组织内非肿瘤细胞，如：血管内皮细胞、小胶质细胞、淋巴细胞或反应性星形胶质细胞的胞核为棕黄色颗粒样染色，或阳性肿瘤细胞数＜10%，均视为阴性[4]。免疫组化结果由两位病理医师采用双盲法阅片判定，如有判定争议的标本，则不纳入实验统计。

1.3.2 1p/19q荧光原位杂交结果判断 使用40倍物镜以多个肿瘤细胞区域进行扫描，确定样本是否有异质性，选择细胞核分布良好的区域，使用100倍物镜按照一定的方向计数。各计数200个细胞核中1p36信号数和1q21信号数及19q13信号数和19p13信号数，计算1p36信号数与1q21信号数及19q13信号数与19p13信号数的比值，根据两者比值判断是否有缺失，若1p36/1q21＜0.7和/或19q13/19p13＜0.7则视为有缺失。

1.4 统计学方法

用SPSS20.0统计分析软件包进行数据处理。多组间突变率的比较用多个样本率的χ2检验，其中当有理论频数＜5时用似然比χ2检验，当理论频数均大于5时用非校正χ2检验；两组间突变率的比较用两样本率的χ2检验，其中当有理论频数＜5时用校正χ2检验，当理论频数均＞5时用非校正χ2检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ATRX在星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤及少突星形细胞瘤中的表达情况

53例病例中，星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤及少突星形细胞瘤ATRX突变（ATRX表达为阴性）率分别为60.0%、44.4%及50.0%（表1）。少突星形细胞瘤ATRX突变率与星形细胞瘤比较差异无统计学意义（χ2=0.292，P=0.589），少突星形细胞瘤ATRX突变率与少突胶质细胞瘤比较差异无统计学意义（χ2=0.080，P=0.778）。

表1 ATRX在星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤及少突星形细胞瘤中的表达（例）

2.2 星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤及少突星形细胞瘤中染色体1p/19q缺失情况

本研究共检测了25例病例中的1p和19q缺失情况，其中包括星形细胞瘤3例（WHOⅡ级1例，WHOⅢ级2例），少突胶质细胞瘤14例（WHOⅡ级6例，WHOⅢ级8例），少突星形细胞瘤8例（WHOⅡ级2例，WHOⅢ级6例）。星形细胞瘤染色体1p，19q及1p/19q缺失率均为0，少突胶质细胞瘤染色体1p，19q及1p/19q缺失率分别为54.5%、0和45.5%，少突星形细胞瘤染色体1p，19q及1p/19q缺失率分别为12.5%、0和0。少突星形细胞瘤染色体1p/19缺失率（包括共缺失及单缺失）与星形细胞瘤比较差异无统计学意义（P=0.055）；少突星形细胞瘤1p/19缺失率（包括共缺失及单缺失）与少突胶质细胞瘤比较差异有统计学意义（P=0.011）；少突胶质细胞瘤染色体1p/19缺失率（包括共缺失及单缺失）与非少突胶质细胞瘤（包括星形细胞瘤及少突星形细胞瘤）比较差异有统计学意义（P=0.032，表2）。

表2 不同组织学类型胶质瘤染色体1p/19q缺失（例）

2.3 联合检测星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤及少突星形细胞瘤中ATRX表达与染色体1p/19q缺失情况

同时检测ATRX表达及1p和19q杂合性及共缺失情况的25例病例中，ATRX表达及1p/19q缺失情况在3者之间的分布见表3，其中8例少突星形细胞瘤中有5例未发现存在ATRX突变及1p/19q缺失；3例星形细胞瘤均存在ATRX突变，10例少突胶质细胞瘤存在1p/19q杂合性或共缺失。少突星形细胞瘤与星形细胞瘤及少突胶质细胞瘤比较差异有统计学意义（P=0.046，P=0.003）。

表3 不同组织学类型胶质瘤ATRX表达及1p/19q缺失（例）

3 讨论

随着分子生物学的发展，一些肿瘤的发生遗传学基础逐步被阐明，2014年国际神经病理学会议上确立中枢神经系统（CNS）肿瘤的诊断需要整合客观的分子数据，并形成了WHO（2016）中枢神经系统肿瘤分类（新版分类）[1]。2016版CNS肿瘤分类标准中，少突星形细胞瘤的诊断存在巨大争议。新分类强调，组织学上的少突星形细胞瘤需要进行肿瘤基因检测后归为星形细胞瘤或少突胶质细胞瘤。然而，在日常的诊断工作中，根据WHO推荐的分子标记物对少突星形细胞瘤进行重新分类，仍会出现以下无法归类的病例。

IDH、ATRX和1p/19q等3个分子标记物对于胶质瘤的诊断及其判断预后非常重要。在弥漫性胶质瘤中IDH1和IDH2突变都有发生，但以IDH1突变为主[5-7]。弥漫性星形细胞瘤（特别是WHO II和Ⅲ级），少突胶质细胞瘤，继发性胶质母细胞瘤IDH1突变率达70%[8-10]。ATRX基因是2011年首次发现在CNS肿瘤中存在突变缺失的[11]，随后研究发现ATRX突变可见于成人型弥漫性星形细胞瘤（45%～67%）、间变性星形细胞瘤（57%～73%）和继发性胶质母细胞瘤（33%～57%）及儿童型脑干弥漫性星形细胞瘤（22%）和非脑干高级别胶质瘤（48%），成人型原发性胶质母细胞瘤很少见（4%～8%）[12-15]。有ATRX突变的胶质瘤均同时存在IDH突变，同时存在这两种突变的肿瘤中，大部分又同时具有Tp53突变[16-18]。因此同时存在IDH和ATRX突变的胶质瘤可作为病理诊断星形细胞瘤的诊断要点。少突胶质细胞瘤与染色体1p/19q共缺失具有强烈的相关性[19]。研究发现，具有染色体1p/19q缺失的病例常常伴随IDH基因突变，但与TP53突变相互独立，并与ATRX突变相互排斥，因此有助于星形细胞瘤与少突胶质细胞瘤相互鉴别[20-21]。

本研究中，星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤及少突星形细胞瘤均存在不同程度的ATRX突变（15/25，8/18，5/10），同时检测染色体1p/19q在3者中缺失率，发现染色体1p/19q无论是共缺失还是1p单缺失主要存在于少突胶质细胞瘤中，而星形细胞瘤及少突星形细胞瘤染色体1p/19q缺失率明显降低，这一点与文献报道少突胶质细胞瘤与染色体1p/19q缺失相关一致，也进一步证实染色体1p/19q缺失在少突胶质细胞瘤诊断中的作用。在检测的8例少突星形细胞瘤中，其中7例未发现存在染色体1p/19q缺失（缺失率仅为12.5%），按照WHO（2016）中枢神经系统肿瘤分类（新版分类），未能归为少突胶质细胞瘤。然而，与星形细胞瘤相比，少突星形细胞瘤的ATRX表达与染色体1p/19q缺失情况与前者又具有一定的差异性。因此，根据WHO（2016）中枢神经系统肿瘤分类（新版分类），在未发现存在染色体1p/19q缺失的少突星形细胞瘤是否可以完全归类于星形细胞瘤，还有待进一步研究。

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Significance of expression of IDH-1, ATRX and molecular genetic alterations of chromosome 1p/19q in diagnosis of astrocytoma, oligodendroglioma and oligoastrocytoma

ZHI Cheng, LAI Miaoling, HAO Zhuofang, MEI Kaiyong, OUYANG Xiaoming, WENG Jieling, ZHONG Ling, TANG Tian, LI Lina

Department of Pathology, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260, China

ObjectiveTo explore the expression of α-Thalassemia/Mental Retardation Syndrome X-linked (ATRX) and molecular genetic alterations of chromosome 1p/19q in diagnosis of astrocytoma, oligodendroglioma and oligoastrocytoma.MethodsWe analyzed ATRX expression status by immunohistochemistry in 53 patients with astrocytoma, oligodendroglioma or oligoastrocytoma.The molecular genetic alterations of chromosome 1p/19q with fluorescence in situ hybridization in these tumors were analyzed.ResultsThe mutation rate of ATRX in astrocytoma, oligodendroglioma or oligoastrocytoma were 60.0%, 44.4%, 50.0%; The loss rates of chromosome 1p, 19q and 1p/19q were0%, 0%, 0% in astrocytoma; 54.5%, 0%, 45.5% in oligodendroglioma and 12.5%, 0%, 0% in oligoastrocytoma respectively, with significant differences between oligodendroglioma and non-oligodendroglioma (P=0.032). Conjoint analysis of ATRX mutation and loss rates of chromosome 1p, 19q and 1p/19q status defined 3 subtypes of gliomas, with significant difference (P=0.046,P=0.003).ConclusionsThe loss of 1p/19q is mainly occurred in oligodendroglioma, which can be used as a oligodendroglioma marker in diagnosis. There are significant differences between astrocytoma and oligoastrocytoma about the molecular genetic alterations.

astrocytoma; oligodendroglioma; oligoastrocytoma; ATRX; 1p/19q; immunohistochemistry; fluorescence in situ hybridization

2017-09-12

郅 程，主治医师，硕士，E-mail: zhichengcy0125@163.com

郝卓芳，E-mail: patty128@163.com